Гетерохроматин и модификаторы экспрессии генов Drosophila melanogaster

• Автор: Попкова, Анна Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТРИСТИКА РАБОТЫ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Гетерохроматин . и эффект положения генов.

Гетерохроматин Ххромосомы i .

1 Цитологическая характеристика.

2 Компоненты гетерохроматина Ххромосомы.

3 Генетические локусы Ххромосомы.

Эффект положения мозаичного типа.

1 Временная регуляция и тканевая специфичность инактивации.

2 Интенсивность эффекта положения зависит от размера цисдействующсго гетерохроматинового блока.
3 Эффект положения может быть обусловлен взаимодействием разобщенных блоков гетерохроматина.

4 Модификаторы эффекта положения.

5 Классификация геновмодификаторов эффекта положения.
6 Модели инактивации при эффекте положения.
7 Эффект положения гетерохроматиновых генов.
8 Инактивация генарепортера в трансгенных конструкциях.
Роль структуры хроматина в регуляции экспрессии генов.
1 Псрсмодслирование нуклеосом.
2 Модификация гистонов.
3 Замещение гистонов.
4 Инсуляторы.
5 Роль РНК в экспрессии генов и создании структуры хроматина.
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ЛИНИИ . И СКРЕЩИВАНИЯ
1 Линии с модификаторами эффекта положения
2 Линии с хромосомными перестройками
3 Скрещивания для оценки влияния модификаторов эффекта положения.
4 Линии и скрещивания для картирования ХАВО
5 Линии для картирования мутации i
6 Линии с трансгенными конструкциями на основе Рэлсмснта
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ
1 Выделение ДНК из имаго .
2 Рестрикция ДНК
3 Гсльэлектрофорез Д1I
4 Включение метки в ДНК метод случайной затравки
5 Саузернгибридизация
4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование трансдействия модификаторов на эффект положения в серии эугстерохроматических перестроек . .
1 Структуры перестроек v . .
2 Анализ влияния модификаторов эффекта положения на инактивацию гена в эу гетерохроматиновых инверсиях и транслокациях.
Исследование эффекта положения гена в нехватках, удаляющих фрагменты дистального гетерохроматина Ххромосомы.
Супрессор v3 оказывает особенно сильное влияние на инактивацию, определяемую взаимодействием разобщенных фрагментов гетсрохроматина.
Картирование гетерохроматинового локуса ХАВО.
1 Молекулярная характеристика нехваток, использованных для картирования ХАВО.
2 Оценка эффекта делений дистального Хгстерохроматина на плодовитость самок, несущих мутацию .
3 Локус ХАВО удален в делении
4 Большая часть регулярных тандемных повторов находится дистальнее области ХАВО.
5 Гетерохроматиновый локус ХАВО может частично перекрываться с районом повторов .
6 Обсуждение результатов картирования ХАВО.
Поиск модификаторов инактивации репортерного гена iii, вызываемой гетерохроматиновыми повторами .
Получение мутации i Г.
Картирование мутации
1 Рекомбинационное картирование мутации 1.
2 Делециониос картирование мутации .
3 Тест на комплементацию.
Влияние мутации i на экспрессию трансгенов.
1 Мутация подавляет экспрессию iii в конструкциях, содержащих гетерохроматиновые повторы.
2 Эффект мутации на экспрессию трансгенного iii зависит от места встройки конструкции в геном.
3 Мутация не влияет па экспрессию i при эффекте положения.
4 Мутация не влияет на экспрессию i с энханссром, окруженного
инсуляторами.
5 Обсуждение возможной функции i.
6 Перспективы исследования мутации i.
Заключение
5 ВЫВОДЫ
6 ПРИЛОЖЕНИЕ 1
7 ПРИЛОЖЕНИЕ 2
8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
1 Общая характеристика работы.
Актуальность


Проведено картирование локуса АВО в гетерохроматине Ххромосомы с использованием делециий, в которых отсутствие разных фрагментов дистального гетерохроматина подтверждено с помощью молекулярного анализа. Показано, что область локализации АВО может перекрываться с районом расположения повторов представленных поврежденными копиями гетерохроматинового гена с инсерциями мобильных элементов. Выявлена и локализована новая мутация i , обладающая плейотропным эффектом. Мутация снижает выживаемость, искажает морфологию глаза и по разному влияет на экспрессию репортерного гена в составе разных трансгенных конструкций, в том числе тех, где трансгсн соседствовал с гетерохроматиновыми повторами разной природы. Эффект мутации на экспрессию репортерного гена зависел от его локального геномного окружения, что дает основание предполагать участие локуса I в создании специфической структуры хроматина в районе инсерции трансгена. Практическая ценность. Дальнейшее исследование мутации , полученной в настоящей работе, может привести к выявлению нового белка, участвующего в формировании структуры хроматина. Полученные результаты по картированию ХЛВО позволяют перейти к следующему этапу его исследования созданию трансгенных конструкций, содержащих последовательности гетерохроматина и функциональному тесту на способность этих последовательностей компенсировать эффект мутации АВО. I Работа апробирована на лабораторном семинаре в Отделе молекулярной генетики клетки ОМГК ИМГ РАН, на Ученом Совете ИМГ РАН, на совместном семинаре лаборатории генетики Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и лаборатории биохимической генетики животных ИМГ РАН. Список цитированной литературы состоит из работ. Гстерохро. Первоначально гетерохроматином были названы участки хромосом, остающиеся конденсированными на протяжении клеточного цикла. В геномах эукариот гетерохроматин соответствует центромерным и теломерным районам хромосом, содержащим мало генов и характеризующихся задержкой репликации, в противоположность эухроматиновым хромосомным плечам, содержащим много генов, рано реплицирующимся и декопденснрующимся в интерфазе. Гстерохроматин i составляет приблизительно генома. До сих пор нет полного сиквенса последовательности гетерохроматина, поскольку изучение структуры гетерохроматина осложнено наличием высоко повторяющихся последовательностей. Один из подходов изучения гетерохроматина это исследование эффектов положения генов инактивации гена, перенесенного из своего обычного окружения в близость к гетерохроматину и получение мутаций но генам, кодирующим белки, которые связываются с гетерохроматином. Такие гены выявляются как модификаторы эффекта положения. Другой подход может состоять в клонировании и составлении физической карты районов гетерохроматина, в сочетании с генетическим анализом гетерохроматиновых локусов. Оба этих подхода к исследованию гетерохроматина использованы в настоящей работе. Гетерохро. Ххромосомы i . Цитологическая характеристика. Дифференциальные окраски. В прицентромернои гетсрохроматинс Ххромосомы выявляются 8 секций обозначаемых номерами . Эти районы выделяются с помошыо различных дифференциальных окрасок препаратов метафазных хромосом i, i . Нокраски основаны на избирательном связывании различных флуорохромов с ДНК хромосом и служат для выявления АТбогатых районов. Оокраска обработка хинакрином, при Нокраскс обработке но методу Хекст осЬб обнаружена задержжа компактизации разных районов гетерохроматина. Ыокраска последовательное удаление из хромосом ДНК, РНК и кислоторастворимых белков с последующей окраской по Гимза позволяет выявлять районы ядр,пикового организатора. X



Рисунок 1. Гетерохроматин Ххромосомы дрозофилы. Обозначены сегменты гетсрохроматина i, i . Указано расположение сателлитов 1. Эухроматин показан пунктирной линией. Внизу указано расположение гетерохроматиновых точек разрыва инверсий, использованных для картирования элементов гетерохроматина Жимулев . X правое плечо Ххромосомы. Xлевое плечо Ххромосомы. С центромера.