Идентификация и молекулярно-генетический анализ генов Arabidopsis thaliana, контролирующих чувствительность к гербициду ацифлюорфену

• Автор: Апчелимов, Алексей Андреевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 190 с. : ил.

1. Общие этапы

2. Биосинтез хлорофилла

3. Биосинтез гема

4. Внутриклеточная локализация ферментов

II. Регуляция биосинтеза тетрапирролов

У. Генетическая регуляция этапов от глутамата до Рго1о1Х

2. Генетическая регуляция этапов от Рго1о1Хдо гема

3. Генетическая регуляция этапов от РгоШХдо хлорофилла

III. Фотодинамическис гербициды

. Формирование активных форм кислорода в результате

нормального функционирования фотосинтетического аппарата

2. Гербициды, повреждающее действие которых зависит от света
3. Ингибиторы протопорфириногеноксидазы
IV. Механизмы устойчивости к ацифлюорфену
V. Неспецифические механизмы устойчивости
2. Специфические механизмы устойчивости
V. Использование трансгенных растений с изменениями в пути
биосинтеза тетрапирролов в сельском хозяйстве
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Растительный материал и условия выращивания растений Условия выращивания
Состав сред Квитко и МБ Морфофизиологический анализ
2. Виды и штамы бактерий и условия выращивания
Условия выращивания Состав сред УЕВ,
3. Выделение нуклеиновых кислот Выделение ДНК
Выделение плашидной ДНК Выделение РНК
Синтез первой цепи кДНК обратная транскрипция
Изучение транскрипции генов ПЦР продуктов обратной транскрипции ОТГ1ЦР
Электрофорез в агарозном геле
Элюция ДНК из агарозного геля
4. Полимеразная цепная реакция ПЦР и ПЦР в реальном времени Праймеры
Условия проведения ПЦР и ПЦРРВ Секвен ирован не
5. Генетическое картирование с использованием ДНКмаркеров
6. Клонирование ПЦРпродуктов и продуктов лигирования
Получение компетентных клеток . i и . i V
Лигирование
Трансформация
Рестрикция
1. Определение содержания хлорофилла 8. Компьютерные методы анализа РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I. Морфологические и генетические особенности мутантов i
1. Генетический анализ мутантов i
2. Анализ нуклеотидной последовательности гена 5I1 у мутантов i5I, i и i
3. Анализ производной аминокислотной последовательности белка, кодируемого геном III1 у мутантов i
4. Изучение фенотипических отличий мутанта аа5 от других
мутантов по гену СНЫ 1 и анализ возможной роли гена СНЫ 2 в
функционировании Мдхелатазиого комплекса
4.1 Анализ взаимодействия мутаций аа5 и ся
4.2 Анализ транскриптов аллелей гена СНЫ 1 у белых растений сяаЫ
5. Анализ производной аминокислотной последовательности белков, кодируемых генами СНЫ I и СНЫ
6. Анализ полиморфизма генов СНЫ 1 и СНЫ 2
7. Создание конструкции для агроб а сериальной трансформации с
геном СНЫ I на основе бинарной векгорной системы
рСАМВ1А .
7.1 Клонирование гена СНЫ 1А0 в вектор рОЕМ и рСАМВА .
7.2 Создание рекомбинантного гена СНЫ 1СНЫ 2 на основе бинарной векторной системы рСАМВ1А.
8. Анализ молекулярногенетических механизмов устойчивости к ацифлюорфену у му танта ас
II. Морфологические и генетические особенности мутанта ас
1. Морфофизиологические особенности мутанта ас8
2. Молекулярногенетическое картирование гена АС
3. Анализ нуклеотидной последовательности гена АСШАТАЯЕ 2 у мутанта аа
4. Анализ производной аминокислотной последовательности белка, кодируемого геном АТА8Е 2 у мутантов аЫ
5. Анализ полиморфизма гена АТАБЕ 2
6. Анализ молекулярногенетических механизмов устойчивости к ацифлюорфену у мутанта аЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
БЛАГОДАРНОСТИ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 ПРИЛОЖЕНИЕ
порядке
АДФ адснозиндифосфат
АТФ аденозинтрифосфат
БАП бензиламинопурин
ДНС додецилсульфат натрия
НАДФ никотинамиддинуклеотидфосфат
НУК нафтилуксусная кислота
ОТПЦР полимеразная цепная реакция с матрицы РНК ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЦРРВ количественная полимеразная цепная реакция с кДНК в реальном времени
РТЦР полу количественная полимеразная цепная реакция с кДНК ЦТАБ цетилтриметиламмоний бромид ii ii , i i5 мутант i i i, толерантный к ацифлуорфену с хлорофилыюй недостаточностью i8 мутант ii i, толерантный к ацифлуорфену с мозаичными белыми пятнами на листьях 5аминолевулиновая кислота
маркер v ii i рестрикционный
анализ амплифицированных последовательностей
раса i ii i
СРОХ копропорфириногеиШдекарбоксилаза окисляющая
раса i ii i
V дивинлхлорофиллид редуктаза
глутамат дегидрогеназа
глутамин сингаза
глутамштР Кредуктаза
глутамин оксоглютарат аминотрансфераза
глутамат 1семиальдегид2,1 аминотрансфераза
хслатаза
цикл аза протоюрфиринХ монометилового эфира
протоорфиринХмстилтрасфераза
IX протопорфирин IX
IX протопорфирин IX
протохлорофилид оксидоредукгаза
IX протопорфирин IX
РРОХ нротопорфириногсн 1Хоксидаза
ВВЕДЕНИЕ


Необходимо отметить, что уроиорфириноген и большинство последующих промежуточных молекул пути метаболизма фоточуствительны и могут производить синглетный кислород. УронорфириногенШдекарбоксилаза рис. III. Кислородзависимая копропорфириногенIIIдекарбоксилаза окисляющая СРОХ, рис. I и II кольцах в винильные радикалы, что ведет к образованию протопорфириногена IX. Рисунок 1. Биосинтез тетрапирролов в высших растениях по , и , , . Синими стрелками указаны пути биосинтеза, отсутствующие в высших растениях. В геноме . Шдекарбоксилазу. IX IX. У ii i есть негомологичный ген, кодирующий РРОХ, названный , молекулярный вес которого . У цианобактерий предполагают новый тип РРОХ, так как никаких гомологов для генов или в геномах большинства исследованных цианобактерий не обнаружено i, , . IX способен хслатировать атомы металлов, и в разных метаболических путях в него могут встраиваться атомы , , , Со. В биосинтезе хлорофилла АТФзависимая нротопорфиринСМхслатаза рис. IX атом , образуя протопорфирин IX IX. Данный фермент состоит из трех типов субъединиц , и СНЫ, функции которых активно исследуются. Синтез протопорфириногена является, таким образом, точкой разветвления синтеза гема и хлорофилла. В митохондриях работают другие изоформы РРОХ и хелатазы. Далее аденозилЬметионин птпфиинXмстилтрансфераза рис. IX монометиловый эфир. IX монометилового эфира включает атомарный кислород, формируя 3,8дивинил протохлорофилл ид. В растениях, кислородзависимая катализирует эту реакцию, тогда как пурпурные бактерии и цианобактерии содержат и кислородзависимую и кислороднезависимую . Кислороднезависимая включает в нротопорфиринIX монометиловый эфир кислород из воды . Каталитическая субъединица растительной кодируется геном . Эта реакция абсолютно свстозависима в покрытосемянных растениях, потому что они содержат только светозависимую , которая принадлежит к семейству дегидраз с короткой цепью. Другие растения, морские водоросли, и цианобактерии содержат и светозависимую, и светонезависимую , последняя схожа с нитрат редуктазой i, , , i, . Вследствие присутствия светонезависимой , эти организмы могут синтезировать хлорофилл в темноте. В кольца 3,8дивинил хлорофиллида редуцируется до с 3винил хлорофиллида моновинил хлорофиллид а дивинл хлорофиллид редуктазой V, рис. Эта редуктаза также может редуцировать 3,8дивинил протохлорофиллид однако, эффективность этого субстрата в основном ниже, чем у 3,8дивинил хлорофиллида как i viv, так и i vi , не опубликованное i не опубликованное. Таким образом, возможен другой порядок реакции, как в схеме на рисунке 1 V реакция после реакции. Последний этап ветви биосинтеза хлорофилла с хлорофилл синтетазой приводит к формированию хлорофилла а. Часть пула хлорофилла а преобразуется в хлорофилл рис. Этапы, ведущие к образованию сирогема обозначены на рисунке 1 цифрами , , . IX, формируя протогем гем , рис. Растения синтезируют и другие типы гема, такие как гем а и гем с. Гем оксигеназа катализирует окисление и размыкание кольца протогема, образуя биливердин IX а рис. I . Эта реакция сопровождается конверсией в ЗЕфитохромобилин фитохромобилин синтазой. Изомеризация ЗЕфитохромобилина в 3 изомер происходит прежде, чем хромофор ассоциируется с фитохром апопротеином. В настоящее время не известно, катализируется ли этот шаг изомеризации ферментом или это происходит спонтанно i, . Почти весь биосинтез тстрапирролов протекает в пластидах. И сирогем, и ветви хлорофилла, их продукты функционируют исключительно в пластидах. Все известные этапы синтеза фитохромобилииа также находятся в пределах пластид i . Положение хелатазы в пути биосинтеза хлорофилла говорит а ii о локализации в хлоропласте, однако на момент начала исследований точное расположение вызывало споры среди ученых. Данные были весьма противоречивыми. Согласно исследованиям, проводившимся в начале х на горохе i iv при разделении стромы и мембранной фракции хлоропластов активность хелатазы терялась, а при их объединении восстанавливалась, что позволило сделать вывод о мультимерном строении данного фермента, с хотя бы одним компонентом, связанным с мембраной хлоропластов , ii, .