Получение трансгенных растений-продуцентов бычьего γ-интерферона

• Автор: Савельева, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 191 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Растительные системы в фармакологии и медицине.

1.1.1. Преимущества растительных систем.

1.1.2. Растительные продуценты

1.1.2.1. Растения продуценты рекомбинантных белков

1.1.2.2. Растения продуценты рекомбинантных антител.

1.1.2.3. Растения вакцины.

1.2. Биот ехнология растений

1.2.1. Методы трансформации растений

1.2.1.1. Агробактериальпая трансформация

1.3. Вопросы, возникающие при создании трансгенных растений продуцентов фармакологически значимых белков
1.3.1. Отбор трансгенного хматерпала.
1.3.2. Наследование перенесенных генов
1.3.3. Экспрессия гетерологичных генов
1.3.4. Гликозилирование белков в растительных системах
1.3.5. Эффективность растительных систем накопление целевого продукта
1.4. Иммуност имуляторы для животноводства
1.4.1. Интерферон и его функции.
1.4.1.1. Классификация интерферонов.
1.4.1.2. Участие уинтерферона в системе иммунного ответа.
1.4.2. Создание и применение препаратов уинтерферона в медицине и ветеринарии.
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
.1. Растительный материал.
И. 1.1. Стерилизация семян
II. 1.2. Условия культивирования растительного материала
И. 1.3. Селекция трансгенных растений табака и гороха.
.2. Ш гамм АгоЬаМепит ШтеасьепБ.
.2.1. Условия культивирования агробактериального штамма.
.3. Методы агробактериальной трансформации
.3.1. Метод трансформации листовых дисков табака i vi.
.3.2. Метод трансформации незрелых зародышей гороха i vi
.3.3. Метод трансформации цветков гороха i viv
.3.4. Метод трансформации проростков гороха i .
.4. Молекулярные методы.
.4.1. Выделение геномной растительной ДНК.
II.4.2. Выделение тотальной ДНК i iii.
П.4.3. Выделение тотальной растительной РНК.
.4.4. Постановка реакции обратной транскрипции
.4.5. ПЦРанализ
.4.6. Разделение продуктов ПЦРреакций методом электрофореза
.4.7. Экстракция цитоплазматических белков из растительного материала.
.4.8. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония
И.4.9. Диализ белковых проб.
.4 Разделение белков методом электрофореза в ПААГ.
.4 Окрашивание гелевых пластин.
.4 Весгернблот анализ.
.4 Дотблот анализ.
I.5. Изучение активации иммунного ответа у лабораторных мышей
.5.1. Серологический анализ крови
.5.2. Иммуиоферментный анализ
II.6. Статистические методы н компьютерная обработка.
.6.1. Статистические методы
.6.2. Построение денситограмм
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
III.1. Получение линий трансгенных растений табака продуцентов уинтерферона, характеризующихся стабильным наследованием и высоким уровнем экспрессии гетерологичного гена
III. 1.1. Анализ наследования гена уинтерферона у трансгенных растений
табака ТГТ3
III. 1.2. Анализ уровня и стабильности экспрессии гена уинтерферона у
трансгенных растений табака Т0Т
III. 1.2.1. Анализ стабильности экспрессии гена уинтерферона у трансгенных растений табака ТГТ3.
1. 1.2.2. Изучение экспрессии гетерологичного гена уинтерферона у потомков исходных трансформантов I и I1 ТрТЧ методом ПЦР
анализа в реальном времени.
III. 1.3. Анализ белковых проб трансгенных растений табака семей I1 и
I.
III. 1.4. Изучение активации иммунного ответа у лабораторных мышей.
III. 1.4.1. Приготовление белкового экстракта, содержащего уинтерферон из
трансгенных растений табака линии I.1.
III. 1.4.2. Анализ активности уинтерферона, выделенного из трансгенных
растений линии I1.2 на лабораторных мышах
III.2. Создание съедобных нммуномодуляторов на основе растений гороха.
1.2.1. Трансформация культуры гороха i vi
1.2.1.1. Изучение регенерационной способности растений гороха в условиях i vi
1.2.1.2. Изучение корнеобразования у растений гороха в условиях i vi
I.2.1.3. Изучение влияния селективного агента Кш на процесс трансформации и определение сублетальной концентрации для культуры гороха
1.2.2. Трансформация гороха i viv
1.2.2.1. Трансформация цветка
1.2.2.2. Трансформация проростков гороха i .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Однако, прежде чем перейти к современному состоянию фармацевтической биотехнологии растений, необходимо упомянуть и об одном из первых этапах развития растительной биотехнологии созданию растений с улучшенными . Одна из первых работ в этом направлении это создание сорта золотого риса, зерна которого богаты витамином А. Данный сорт риса был получен с помощью методов генной инженерии путем введения гена фитоинсинтетазы нарцисса ключевого фермента, участвующего в биосинтезе каротина провитамина А. Таким образом, употребляя этот сорт риса в пищу, люди могут устранить дефицит витамина А в организме без применения лекарственных препаратов Р. К. . С.К. Рукавцева Е. Б. и др. К настоящему времени созданы трансгенные растения земляники с повышенным синтезом аскорбиновой кислоты i . Е в семенах V . После успешных работ по созданию растений с улучшенными лечебнодиетическими свойствами исследователи перешли к следующему этану созданию растенийпродуцентов рекомбинантных белков i . Белки являются большими органическими молекулами, длиной от 0 до аминокислот. Их трехмерная структура и функциональные возможности определяются последовательностью аминокислот. Сложные белки в процессе созревания подвергаются фосфорилированию или гликозилированию, что влияет на их функции. Лишь короткие пептидные цепи, длиной менее аминокислот, могут быть синтезированы химическим путем, тогда как более крупные белки должны продуцироваться живыми клетками . Попытки синтезировать животные белки в растительных системах увенчались успехом в г. Первым фармацевтически значимым белком, вырабатываемым растениями табака и подсолнечника, стал человеческий гормон роста . После этой работы множество ценных белков было эффективно синтезировано в растениях. Среди них были белки сыворотки крови человека, регуляторы роста, антитела, вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Таким образом, были получены доказательства возможности успешного использования растительных систем для производства рекомбинантных белков в промышленном масштабе Рукавцева Е. Б. и др. Примеры некоторых фармацевтически ценных белков, синтезируемых трансгенными растениями в настоящее время, приведены в таблице 1. Многие из этих белков представляют собой продукты крови человека, такие как человеческий сывороточный альбумин годовое производство более 0 тонн, цитокины и другие сигнальные молекулы. Таблица 1. Терапия СПИДа i . Соматотропн 1 ормон роста . X6 . Энкефалины Передозировка наркотических веществ Vvv . Эпидермальный фактор роста Стимуляция клеток кожи и роговицы i . Ринтерферон Гепатиты В и С, опоясывающий лишай, вру сны с бородавки . Хронический грануломатоз, лейшманиоз, лепра vi . Эритропоэтин Анемия i . Глюкоцереброзидаза Болезнь 1 ошс . Рпемопюбин Заменитель крони i . Г ранулоцитмакрофагстимулирующий фактор Ангираковая терапия . Коллаген Заживление ран . Кальмодулин Активатор белков i . Рицин В А дью вант v. Альбумин сывороточный человеческий Цирроз печени, ожога i. Интерлейкины 1Ь2, Ь4. Ы0, П. Ь Лейшманиоз. Ы i. Мепагма , . Эластин Восстановление понрежлепных сухожилий, стенок СОСУДОВ . Пищевая добавка . X. . III i . А. . Модифицировано Рукавцева Е. В г. Хиаттом с соавторами была впервые получена экспрессия антител в растениях табака i . Данная работа стала доказательством того, что растения могут синтезировать не только простые гетерологичные пептиды, но и собирать сложные функциональные гликопротеины, состоящие из нескольких субъединиц. Было показано, что типичные антитела представляют собой тетрамеры из двух идентичных тяжелых и двух легких цепей. Кроме того, существуют и более сложные формы, например, секреторные антитела, представляющие собой димеры обычных антител и включающие две дополнительные полипептидные цепи. Известно, что для сборки таких антител в животных тканях необходимо два типа клеток, в то время как растения могут осуществлять аналогичную сборку антител в одной клетке. Примером может служить создание четырех типов трансгенных растений, синтезирующих отдельные цепи иммуноглобулинов. Такие антитела обладали иммуногенностью, они накапливались в клетках в количестве до 1,3 от суммарного растворимого белка . Рукавцева Е. Б. и др.