Исследование стрессоустойчивости генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы

• Автор: Колодяжная, Янина Станиславна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 97 с. : ил.

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Синтез осмолитов как способ повышения устойчивости к абиотическим 8 стрессовым воздействиям.

1.2. Устойчивость растений к абиотическим стрессам

1.2.1. Солеустойчивость растений.

1.2.2. Засухоустойчивость растений.

1.2.3. Устойчивость к изменениям кислотности почвы

1.2.4. Устойчивость растений к токсическим концентрациям тяжелых металлов.

1.3. Роль пролина при стрессе.

1.4. Методы получения трансгенных растений.
1.5. Явление сайленсинга у трансгенных растений
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.2. Методы получения трансгенных растений табака.
2.3. Анализ наследования маркерного гена прШ в поколениях растений табака.
2.4. Анализ содержания свободного пролина в тканях растений.
2.5. Анализ солеустойчивости ГМ растений.
2.6. Оценка уровня оводненности растений.
2.7. Анализ устойчивости ГМ растений к токсичным аналогам пролина.
2.8. Оценка устойчивости ГМ растений к повышенному уровню солей тяжелых металлов.
2.9. Определение концентрации хлорофиллов а и Ь в листьях растений.
2 Оценка степени повреждения мембран в клетках растений в условиях осмотического стресса.
2 Оценка роста растений на твердых средах с повышенным содержанием агара.
2 Оценка всхожести семян и развития проростков растений табака в
условиях осмотического стресса.
2 Влияние высоких температур на всхожесть семян табака.
2 Определение активности фермента пролиндегидрогеназы в тканях растений.
2 Статистические методы исследования.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение генетически модифицированных растений табака.
3.2. Анализ числа встроенных инсерций по фенотипам проростков в поколении Т1.
3.3. Солеустойчивость генетически модифицированных растений.
3.3.1. Влияние засоления на прорастание семян и развитие проростков.
3.3.2. Влияние засоления на развитие растений табака.
3.4. Устойчивость ГМ растений к токсичным аналогам пролина.
3.5. Устойчивость ГМ растений к осмотическому стрессу.
3.6. Устойчивость ГМ растений к воздействию высоких температур.
3.7. Устойчивость ГМ растений к повышенному уровню солей тяжелых металлов.
Заключение
Выводы
Цитируемая литература
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АБК абсцизовая кислота
БАП 6бензиламинопурин
БТШ белки теплового шока
ГМ растения генетически модифицированные растения
дцРНК двуцепочечная РНК
МДА малонилдиальдегид
МТ металлотионеины
НАД никотинамиддинуклеотид
НУК нафтилуксусная кислота
ПДГ пролиндегидрогеназа
ПЭГ полиэтиленгликоль
ПЦР полимеразная цепная реакция
СОД супероксиддисмутаза
Среда среда Мурашиге и Скуга
ТМ тяжелые металлы
ФХ фитохелатины
ФЭК фотоэлектроколориметр
1.азетидин2карбоксиловая кислота ii
2xi i
5 Дпирролинбкарбоксилатредуктаза
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Растения реагируют на воздействие внешних стрессорных факторов изменением экспрессии генов, интенсивности метаболизма, проницаемости клеточных мембран, баланса ионов в клетках и др. Чиркова, i, Кузнецов, Дмитриева, Ермакова и др. В частности, при стрессовом воздействии на растения в клетках начинают синтезироваться белки, участвующие в транскрипционном контроле, белки теплового шока, осмопротектанты аккумулируются пролин, бетаины, полиамины и т. v . Кузнецов, Шевякова, Баранова и др. В последнее время для придания растениям полезных признаков в процессе выведения новых сортов для различных зон возделывания широко применяются достижения генетики и молекулярной биологии. Одно из таких достижений получение методами генной инженерии растений, устойчивых к различным неблагоприятным факторам окружающей среды. Современный этап развития генетической инженерии растений получил название метаболическая инженерия. К задачам этой отрасли биотехнологии можно отнести создание растений, накапливающих осмолиты например, пролин, способствующих поддержанию тургора клеток, нейтрализующих радикалы и т. В работах многих авторов показана положительная связь между уровнем накопления пролина и стрессоустойчивостью растений Сохансандж и др. Кузнецов, Шевякова, . Однако, роль пролина в обеспечении устойчивости к различным видам стресса изучена недостаточно. ПДГ, дали противоречивые результаты Мапр е1 а Мат е Цель и задачи настоящего исследования. Целью настоящей работы было исследование взаимосвязи между метаболизмом пролина и устойчивостью к различным видам абиотических стрессов на модели генетически модифицированных ГМ растений табака. Получить линии ГМ растений табака, несущие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы ПДГ и характеризующиеся повышенным содержанием пролина. Изучить наследование генетической конструкции в потомствах генетически модифицированных растений, полученных от самоопыления растений трансформантов. Научная новизна и практическая ценность. Впервые получены линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы. Впервые показана повышенная устойчивость полученных ГМ растений к широкому спектру абиотических стрессовых факторов засолению, присутствию токсичных аналогов пролина, к токсическим концентрациям тяжелых металлов, к осмотическому стрессу, воздействию засухи и повышенных температур. Стрессовые воздействия окружающей среды угнетают рост и развитие растений, снижая их продуктивность. Важными задачами для современной биотехнологии и селекции является повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к засухе, засолению, заморозкам и другим неблагоприятным средовым воздействиям. Полученные ГМ растения табака можно использовать в качестве модели для изучения роли пролина в обеспечении стрессоустойчивости. Разработанный подход также можно рекомендовать для получения сортов хозяйственноценных растений, характеризующихся повышенной комплексной устойчивостью к различным абиотическим стрессам. Положения, выносимые на защиту. ГМ растения табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы, характеризуются увеличенным содержанием пролина до пятого поколения от самоопыления включительно. Апробация работы. Результаты работы докладывались на российских и международных конференциях 7ой Пущинской школеконференции молодых ученых, конференции МОГИС, Международной конференции Биология растительных клеток i vi и биотехнология, Саратов, Съезде ВОГиС, Москва, III международной научной конференции Факторы экспериментальной эволюции организмов, Украина, Алушта, . Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и подана заявка на патент. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, включает рисунков и фотографий, таблиц в тексте диссертационной работы. Библиографический указатель включает 6 источников.