Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogaster

• Автор: Морозова, Татьяна Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Место защиты: Б.м.
• Количество страниц: 137 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Ретротранспозон i i

1.1 Особенности строения и транскрипции.

1.2 Механизм транспозиции ретротранспозона i

2. Молекулярные механизмы регуляции активности i

2.1 Исследование регуляторных последовательностей МЭ с помощью трансгенных конструкций.

2.1.1 Однокомпонентные вектора на основе Рэлемента.

2.1.2 Система векторов 4.

2.1.3 Система векторов

2.1.4 Тетрациклинзависимая система.
2.1.5 Система векторов x и .
2.1.6 Репортерные гены, используемые в векторах при изучении .
2.2 Регуляторные области ретротранспозона i.
2.3 Геномные факторы, взаимодействующие с регуляторными элементами i.
3. Влияние МЭ на приспособленность
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1 Основные растворы
4.2 Лабораторные линии, использованные в работе.
4.3 Определение индекса конкуренции.
4.4 Определение выживаемости яиц
4.5 зависимая трансформация эмбрионов.
4.5.1 Оборудование для инъекций.
4.5.2 Получение и анализ трансформантов.
4.5.3 Сбор эмбрионов после инъекций.
4.6 Репортерные конструкции, использованные в работе
4.7 Гистохимическая окраска органов на активность ргалактозидазы
4.8 Количественное определение активности галактозидазы
4.9 Молекулярнобиологические методы
4.9.1 Выделение геномной ДНК .
4.9.2 Выделение плазмидной ДНК.
4.9.3 Ферментативная обработка ДНК.
4.9.4 Гельэлектрофорез фрагментов ДНК.
4.9.5 Трансформация бактериальных клеток.
4.9.6 Саузернблот гибридизация
4.9.6.1 Перенос ДНК из агарозных гелей на нейлоновый фильтр
4.9.6.2 Мечение ДНК методом рассеянной затравки
4.9.6.3 Гибридизация с меченым зондом
4. Определение сайтов локализации МЭ на хромосомах.
41 Приготовление давленых препаратов лолитенных хромосом слюнных желез . .
42 Приготовление ДНК зондов, меченых биотином
43 Проведение гибридизации i i.
4. Оценка числа копий и частоты транспозиций МЭ в геноме.
41 Оценка гаплоидного числа копий
42 Измерение частоты транспозиций МЭ.
4. Обработка результатов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 Регуляторные последовательности ретротранспозона i.
5.2 Влияние числа копий ретротранспозона i на приспособленность.
5.2.1 Изменение частоты транспозиций, числа копий i и приспособленности особей в инбредных сублиниях линии 2Ь.
5.2.1.1 Изменение числа копий i.
5.2.1.2 Изменение паттерна сайтов локализации i.
5.2.1.3 Изменение приспособленности в условиях инбридинга и ослабленной селекции в линиях с различной частотой транспозиций i
5.2.3 Число копий ретротранспозонов и приспособленность в линиях 2Ь
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Их также можно разделить на два подкласса транспозоны, для которых характерны короткие инвертированные концевые повторы, и элементы с длинными инвертированными концевыми повторами. МЭ этого класса найдены и у про, и у эукариот , , . Поскольку данная работа посвящена изучению ретротранспозона i, а кроме того, ретротранспозоны представляют собой наиболее многочисленную группу МЭ у эукариот рассмотрим более подробно их строение и особенности перемещения. В эту группу входят мдг1, 2, мдгЗ, 4, i, , Iix, ii, 7, , , и некоторые другие МЭ . По структуре ретротранспозоны сходны с провирусами ретровирусов V, , . И ретротранспозоны, и ретровирусы состоят из кодирующей части, имеющей в разных случаях от одной до трех открытых рамок считывания, соответствующих белкам , и v. Ретротранспозон, как и ретровирус, фланкирован на концах длинными, до нескольких сотен нуклеотидных пар н. ДКП. ДКП можно разделить на три области 35 3 встречается только на Зконце РНКтранскрипта, 5 на 5конце и , встречается на обоих концах. Эти повторы обычно не содержат длинных открытых рамок, но содержат регуляторные последовательности, влияющие на уровень экспрессии МЭ. В настоящее время выделяют две подгруппы ДКПсодержащих ретротранслозонов, названные по наиболее изученным представителям каждой 1iподобные и ТуЗдурэуподобные ретротранспозоны. Представители первой группы не имеют белка v, в то время как представители второй группы, как правило, кодируют белок v, образующий наружную оболочку вирусоподобной частицы. Вследствие этого последние обладают инфекционностью i . . РНК транспортируется в цитоплазму, где происходит синтез белков, их процессинг и упаковка в вирусоподобную частицу полноразмерного транскрипта вместе с обратной транскриптазой и тРНК внутри вирусоподобной частицы происходит синтез ДНКкопии на матрице РНК ДНК транспортируется обратно в ядро где происходит ее интеграция в геномхозяина ЗЫЬа, ва1до, Етоп е1 а1. УозЬюка е В случае ретротранспозонов обратная транскрипция и встраивание в геном разобщены обратная транскрипция происходит внутри вирусоподобных частиц, и в геном встраивается уже готовый полноразмерный ретротранспозон. Рисунок 1. Жизненный цикл ретротранспозонов. Первым этапом транспозиции ретроэлементов является транскрипция. Поскольку образующаяся мРНК является матрицей не только для синтеза ДНК в ходе обратной транскрипции, но и матрицей для синтеза белков, необходимых для ретротранспозиции, то данный этап является критическим в регуляции перемещений ретротранспозонов. Как уже было упомянуто выше, большинство ретротранспозонов дрозофилы активно транскрибируются, и РНК, кодируемая ими, обладает всеми свойствами эукариотической мРНК у нее есть 5сар структура, ОРС и полиАпоследовательность. iv . Как правило, цисдействующие факторы, влияющие на интенсивность транскрипции, расположены в 5ДКП и прилежащей к нему нетранслируемой области. Транскрипция большинства мобильных элементов осуществляется РНКполимеразой II и зависит от клеточных транскрипционных факторов. Для связывания РНКполимеразы II с промоторной областью необходимо наличие ТАТАбокса иили последовательности инициатора, расположенного обычно в районе старта транскрипции. Однако, несмотря на важность инициатора для транскрипции ретротранспозонов дрозофилы, самого по себе его не достаточно, в отличие от инициатора млекопитающих. , . Особенности промоторов ретротранспозонов подробно рассмотрены в монографии И. Р. Архиповой с соавторами iv . Было показано, что последовательность инициатора различается как по нуклеотидному составу, так и по положению относительно старта транскрипции у разных МЭ, и его взаимодействие с РНКлолимеразным комплексом является сиквенсспецифическим. Это говорит о существовании большого числа сиквенсспецифических транскрипционных факторов, или фактора с множественной сиквенсспецифичностью, вовлеченных в регуляцию транскрипции мобильных элементов дрозофилы.