Исследование гена пресенилина 1 человека и его гомологов в модельных системах

• Автор: Григоренко, Анастасия Петровна
• Шифр специальности: 03.00.15, 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.1. Клинические и гистопатологические признаки Болезни Альцгеймера

1.1.2. Генетические факторы и гены Болезни Альцгеймера.

1.2. Функции генов прссснилинов

1.2.1.1. Участие пресенилинов в протеолитическом расщеплении АРР.

1.2.1.2. Участие пресенилинов в протеолитическом расщеплении .

1.2.1.3. Другие субстраты внутримембраиного протеолиза пресенилина.

1.2.2. Обнаружение компонентов усекрстазного комплекса

1.2.3. Участие пресенилинов в апоптозс.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Программы биоинформатики
2.2. Векторы, использованные для клонирования
2.3. Набор методов для получения рекомбинантных конструкций
2.3.1. Эндонуклеазное расщепление ДНК
2.3.2. Переосаждсние ДНК.
2.3.3. Электрофоретическое разделение ДНК фрагментов.
2.3.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.
2.3.5. Лигирование фрагментов ДНК
2.3.6. Культивирование клеток . i
2.3.7. Траиформация клеток . i.
2.3.8. Отбор клонов, содержащих плазмидные конструкции.
2.3.9. Секвенирование
2.4. Общие методы получения кДНК, геномных копий генов, изучения экспрессии генов ОТПЦР
2.4.1. Выделение геномной ДНК из периферической венозной крови
человека.
2.4.2. Выделение тотальной РНК из периферической венозной крови
человека.
2.4.3. Выделение мРНК
2.4.3. Получение кДНК.
2.4.4. Полимеразная ценная реакция ПЦР.
2.5. Частные методы, использованные при клонировании, изучении экспрессии генов на уровне транскрипции.
2.5.1. Получение конструкции для наработки концевого фрагмента белка в клетках Е. i.
2.5.2. Получение конструкций для экспрессии форм альтернативного сплайсинга в культурах клеток млекопитающих.
2.5.3. Изучение экспрессии форм альтернативного сплайсинга в клетках крови человека.
2.5.4. Исследование экспрессии I генов человека
2.5.4.1. Анализ экспрессии ММР1 гена в различных тканях и органах человека .
2.5.4.2. Исследование альтернативных транскрнптов гена ЫМР
2.5.4.3. Получение и клонирование полноразмерных копий альтернативных форм сплайсинга гена II.
2.5.4.4. Получение и клонирование мутантных форм гена ЫМР1.
2.5.4.5. Клонирование делеционных и мутантных форм гена .
2.6. Набор методов для получения и исследования трансфицированных культур клеток млекопитающих.
2.6.1. Культивирование клеток млекопитающих
2.6.2. Подготовка плазмидной ДНК для трансфекции культур клеток млекопитающих
2.6.3. Трансфекция культур клеток с помощью электропорации.
2.6.4. Трансфекция культур клеток НЕК3 с использованием набора iI .
2.6.5. Получение трансфицированных поликлональных культур клеток РС и клонов индивидуальною происхождения
2.6.6. Выделение высокополимерной геномной ДНК клеточных культу р
2.6.7. Анализ стабильнотрансфицированных культур с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР
2.6.8. Хранение полученных клеточных линий.
2.6.9. Изучение дифференцировки РС клеток
2.6 Анализ пролиферации клеток .
2.6 Изучение апоптоза в трансфицированных культурах клеток I 2.
2.6 Выделение белковых гомогенатов из культур клеток . Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестернблоттинг.
2.6 Получение белковых лизатов культур клеток НЕК3. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестернблоттинг.
2.6 Получение антител, использованных в работе.
2.6 Изучение гликозилирования белков.
2.7. Материалы и методы исследования на модели дрожжей vii.
2.8. Материалы и методы исследования на модели нематоды ii
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Создание набора плазмидных конструкций, трансфицированных культур клеток млекопитающих, трансгенных линий i .
3.1.1. Создание набора плазмидных конструкций
3.1.1.1. Плазмидные конструкции для экспрессии в культуре клеток млекопитающих
3.1.1.2. Плазмидные конструкции для экспрессии генов в трансгенных i
3.1.1.3. Плазмидные конструкции для наработки белка в ii i.
3.1.1.4. Плазмидные конструкции для дцРНКи в ii
3.1.2. Создание набора стабильно трансфицированных культур клеток млекопитающих
3.1.3. Получение и анализ трансгенных линий i
3.2.1. Исследование изоформ генов пресенилинов в модели трансфицированных клеточных культур.
3.2.2. Апоптоз и мутантные пресенилины в поликлональных клеточных культурах.
3.2.3. Мутации и высокий уровень непроцсссированной формы замедляют пролиферативную активность и повышают чувствительность к апоптозу моноклональных культур
3.3. Изучение альтернативных транскриптов гена 1 человека.
3.4.1. Обнаружение новых семейств белков, имеющих сходство с пресенилинами.
3.4.2. РАдомен.
3.4.3. Iгепы н Iбелки человека.
3.4.4. Изучение экспрессии гена в тканях и органах человека. Исследование альтернативных транскриптов гена
3.4.5. Изучение экспрессии белка в клетках млекопитающих.
3.4.6. Участие в протеолитнческом расщеплении полноразмерного белка .I
3.4.7. I не является критическим фактором индукции i в vii.
3.4.8. Ингибирование генаортолога у нематоды ii
i
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Впервые исследовано влияние мутаций 0 и 6V в генах пресенилинов на пролиферацию и чувствительность к апоптотическим стимулам на модели трансфицированных клеточных культур феохромоцитомы крысы . Выявлены и описаны различные формы альтернативного сплайсинга гена прссенилина 1 человека, а также впервые разработан чувствительный метод детекции транскрипта прссенилина 1 человека с делецией экзона 9. Идентифицировано новое семейство геновгомологов пресенилинов I I. Впервые клонированы три изоформы гена ИШР1, определены некоторые структурнофункциональные особенности II гена человека и его гомологов в системах клеток млекопитающих, беспозвоночных и дрожжей. Получены как теоретические, так и экспериментальные данные свидетельствующие о том, что II, как и пресснилин, является политопной аспартатной протеазой. Деменции прогрессирующая потеря памяти и интеллекта актуальная проблема здравохранения и социальной сферы в развитых странах. Болезнь Альцгеймера БА наиболее распространенное нейродсгенеративнос заболевание человека в среднем и пожилом возрасте, составляющее всех форм деменций. По данным организации Международной Организации БА i i Ii за год, число больных деменцией в мире вырастет в ближайшие лет с до млн. По другим подсчетам, число больных в году оценивается как млн. Рост случаев заболевания прежде всего связывают с увеличением продолжительности жизни в развитых странах мира. Несмотря на то, что относительная пропорция пожилых людей с деменцией в развивающихся странах ниже, чем в развитых, на долю развивающихся стран приходится около всех случаев деменции, что связано в первую очередь с высокой численностью населения в данных странах i . Исторически БА связана с именем Алоиса Альцгеймера i i немецкого медика, впервые описавшего совокупность гистопатологических признаков заболевания в годах. История болезни летней пациентки Августы Д. Франкфурте на Майне, и умершей в апреле года, послужила основой доклада на конференции психиаторов в Тюбингене 3 ноября года и последующих публикаций года. Пациентка страдала прогрессирующей потерей памяти, нарушениями речи, движения, узнавания, непредсказуемым поведением, галлюцинациями. Паталогоанатомический анализ мозга показал распростанеиную атрофию коры, а также присутствие в кортексс характерных нейрональных бляшек названных позже Альцгеймеровскими или сенильными и нарушение структур нейрофибрилл образование внутриклеточных нейрофибрилляриых клубков. Болезнь Альцгеймера БА, который ввел Эмиль Крэпслин i i, директор королевской психиатрической клиники в Мюнхене, куда Альцгеймер перешел работать из Франкфурта . В настоящее время по ряду классификаций МКБ, IV, различают раннюю иресенильную форму БА, с началом заболевания до лет, составляющую до всех случаев, и позднюю сенильную форму, с началом заболевания после лет. Заболевание Августы Д. БА, а для случаев с поздним началом употребляют термин сенильная деменция альцгеймсровского типа СДАТ. Кроме того, выделяют семейные и спорадические случаи БА. Клиническое проявление БА начинается с ухудшения памяти о недавних событиях, встречах, разговорах, трудностями в пространственной ориентации, потерей интереса к жизни с прщрсссирующим усилением симптомов деменции вплоть до полной потери способностей к узнаванию, ориентировке в пространстве и времени, деградации интеллекта и памяти. Смерть чаще всего наступает от пневмонии или общего истощения viv. Основным гистопатолошческим признаком БА является накопление амилоидных сенильных бляшек и внутриклеточных нейрофибрнллярных клубков, которое сопровождается массовой гибелью нейронов в ряде структур головного мозга. Сенильные бляшки представляют собой нерастворимые сферические образования диаметром около 0,2 мм Рис. А. Типичное строение бляшек центральная, более плотная часть, состоящая в основном из отложений труднорастворимого амилоида пептида, продукта амилоидогенного протеолиза АРР белка предшественника амилоида, окружена кольцом из дистрофичных нейритов. Кроме различных форм амилоида, в состав амилоидных бляшек входят другие белки, такие как глюкозаминоглнкан , гепаран сульфат протеогликан , амилоид Р сыворотки , аполииопротеин Е АроЕ, а2макроглобулин, антихимотриисин, факторы комплемента и др.