Клонирование и анализ генов иммуноглобулинов американской норки

• Автор: Наякшин, Александр Матвеевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 108 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Организация кластера генов тяжелых цепей.

1.2. Эволюция и классификация Унгенов.

1.3. Организация генов Хлегких цепей .

1.4. Д5 и V .

1.5. Эволюция и классификация Хгенов

1.6. Структура локуса клегких цепей

1.7. Эволюция и классификация кгенов

1.8. Генетика ИГ норки4
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Животные
2.2. Псдготозка ДНКзсндов4
2.3. Выделение ДНК плазмид и бактериофагов4
2.4. Выделение поли А4 РНК.
2.5. Конструирование кДНКовой библиотеки
2.6. Скрининг кДНКовой библиотеки антителами.4
2.7. Скрининг кДНКовой библиотеки ДНКзондами4
2.8. Мечение белка А радиоактивным .4
2.9. Определение нуклеотидной последовательности.4
2 Выделение высокомолекулярной ДНК из крови
2 Блотгибридизация .
2 И2муноблоттинг и иммуноферментный анализ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ХГЕНОВ НОРКИ
3.1. Клонирование Хгенов .
3.2. Анализ первичной последовательности Хгенов
3.3. Структура УХлокуса.
3.4. Структура сХлокуса.
Глава 4. КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ кГЕНОВ НОРКИ
4.1. Клонирование кгенов
4.2. Структура локуса кцепей
Глава 5. КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ГЕНОВ уТЯЖЕЛЫХ
ЦЕПЕЙ НОРКИ
5.1. Клонирование генов утяжелых цепей ИГ норки
5.2. Анализ Унобласти
5.3. Особенности первичной структуры Суобласти7
5.4. Функциональные сайты Суцепей норки
5.5. Структура Сулокуса у норки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ 8
ЛИТЕРАТУРА


Характерными чертами этого семейства являются представленность на разных хромосомах, разнообразие форм генов, кодирующих отдельные цепи ИГ и их элементы, перестройка генов з ходе онтогенеза и иммунного ответа, избирательность экспрессии индивидуальных генов в синтезирующих ИГ клетках Нопо еб а1. В совокупности эти свойства делают мультигенное семейство ИГ крайне интересным объектом для изучения различных аспектов эволюции генома эукариот, в частности, молекулярных механизмов эволюции, коэволюции стуктурных и регуляторных последовательностей, возникновения генов с новыми функциями и т. Решение этих проблем вс многом зависит от таксономического расширения сферы исследований, т. ИГ получены при изучении соответствующих локусов человека и мыши. Проведенные в лаборатории иммуногенетики ИЦиГ СО РАН работы по генетике тяжелых цепей ИГ американской норки свидетельствовали о существовании особенностей, касающихся структуры и экспрессии генов ИГ. Как известно, у всех изученных до настоящего времени животных гены тяжелых Н и легких Ь цепей ИГ расположены на разных хромосомах. . В противоречие с классической схемой, у аллотипов Нцепей I норки не обнаружено ни тесного сцепления, ни аллелизма, а анализ количественного проявления аллотипов тяжелых цепей показал, что для некоторых из них характерна вариабельность количественной экспрессии и широкое распространение минорных концентраций Фомичева, . Кроме того, литературные данные свидетельствовали об отсутствии у норки, в отличие от других видов млекопитающих, клегких цепей . Изучение причин этих отклонений от общепринятых представлений о структуре и экспрессии генов ИГ затруднялось полным отсутствием данных о строении этих генов на молекулярногенетическом уровне. Необходимость получения такой информации определила постановку задач диссертационной работы. Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась з изучении на молекулярногенетическом урозне структуры локусов, кодирующих тяжелые цепи иммуноглобулина класса у, а также к и . В ходе работы планировалось решить следующие конкретные задачи 1 клонирозать гены, кодирующие у, к и Лцепи и определить их первичные последовательности, 2 провести анализ последовательностей с целью выявления характерных для норки особенностей, уровня гомологии по отношению к их аналогам у других видев млекопитающих и классификации вариабельных генов, 3 используя полученные специфические молекулярные зонды к различным участкам генов ИГ, оценить количество генов, входящих в у, к и ллокусы. Научная новизна и практическая ценность. В результате работы клонированы и проанализированы гены легких и утяжелых цепей американской норки. Установлено, что геном американской норки содержит 67 СЛ генов, при этом как минимум три из них функциональные и один, вероятно, является псевдогеном. Подгруппа УЛгенов, к которой принадлежат клонированные гены, содержит не менее 1Ъ членов и входит в III группу по принятой на данный момент классификации. Соответствующий локус содержит 1 константный и по меньшей мере 7 вариабельных генов. Константные угены, количество которых оценивается б 46 членов, при учете данных по уровню гомологии и расположению опорных аминокислот наиболее близки к Суобластям овцы и быка. Подгруппа Унгенов, в которую входят клонированные гены, насчитывает не менее члена и вероятно, язляется наиболее представительной среди других г. Унгенов норки. Проведенные исследования структуры и организации генов иммуноглобулинов вносят вклад в частную генетику американской норки и расширяют наши представления о строении одного из наиболее сложных мультигенных семейств генома эукариот. Полученные в процессе работы молекулярные зонды могут быть использованы для дальнейшего изучения генов ИГ норки, в частности для их хромосомной локализации и определения тонкой структуры локуса. Практический эффект от исследования генов иммуной системы, учитывая экономическую важность вида, может быть связан в первую очередь с определением генетических маркеров устойчивости к различным инфекционным заболеваниям . Автор аыргжает благодарность научному руководителю работы А. В.Таранину, а также сотрудникам лаборатории иммуногенетики Е. С.Белоусову, Б. Ю.Алябьеву, Л. А.Бовкун и В. В.Перемыслову за бол шую помощь в работе.