Молекулярные механизмы и генетический контроль устойчивости к солевому стрессу у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803

• Автор: Карандашова, Инга Вадимовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Распространенность цианобактерий и их способность к

акклиматизации

1.2. Осмопротекторы.

1.2.1. Участие осмопротекторов в солеадаптации

1.2.2. Осмопротекторы у цианобактерий и других организмов

1.2.3. Транспорт осмопротекторов

1.2.4. Биосинтез осмопротекторов

1.3. Ионный транспорт в условиях солевого стресса
1.3.1. Изменения концентрации неорганических ионов
1.3.2. Механизмы ионного транспорта.
1.3.2.1. Выведение ионов Ыа
1.3.2.2. Системы транспорта калия.
1.4. Сенсоры и регуляторы осмотических и ионных изменений. .
1.5. Солеиндуцируемые изменения экспрессии генов синтез стрессовых белков
1.6. Влияние солевого стресса на фотосинтез
1.7. Солеиндуцируемые изменения мембранной структуры
1.8. Воздействие солевого стресса на метаболизм азота
1.9. Основные процессы солеадаптации.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.
2.2. Среды и культивирование микроорганизмов.
2.3. Трансформация бактериальных клеток
2.4. Молекулярное клонирование.
2.4.1. Эксперименты с ДИК.
2.4.2. Клонирование фрагментов ДНК, несущих ген устойчивости к Кш, из солечувствительных мутантов ЗупесИосуяиз .
2.4.3. Конструирование инсерционных мутантов ЗупесЪосуьИз .
2.5. Изучение экспрессии генов.
2.5.1. ЫогФегпблот гибридизация
2.5.2. Метод ОТГТЦР
2.6. Измерение содержания гликозилглицерина
2.7. Измерение Ка7ЬГантииортерной активности в клетках ЗупесНосуъНъ
2.8. Измерение содержания ионов натрия и калия в растущих клетках ЗупесЬосузиБ
2.9. Определение скорости поглощения катия.
2 Компьютерное обеспечение
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Идентификация генов, контролирующих устойчивость к солевому стрессу, с использованием солечувствительных мутантов цианобактерии ЗупесИосузИэ .
3.1.1. Идентификация мутаций у ГРмутантов
3.1.2. Идентификация мутаций у ГРмутантов
3.1.2.1. Мутант 7.
3.1.2.2. Мутант
3.1.2.3. Мутант 7.
3.1.2.4. Мутант
3.1.3. Физиологические характеристики мутантов
3.1.4. Обсуждение.
3.2. Функциональный анализ генов, кодирующих Ыа7Нантипортеры у цианобактерии 8утсНосуаИ
3.2.1. Конструирование инсердионных мутантов.
3.2.2. Сегрегация мутаций в генах, кодирующих Рантипортеры.
3.2.3. Физиологобиохимические характеристики мутантов
с нарушением генов, кодирующих а7Нантипортеры
3.2.4. Анализ экспрессии ТНантипортерных генов
3.2.5. Обсуждение
3.3. Участие систем транспорта Кь в солеадаптации
клеток ЗупесНосуБИз
3.3.1. Конструирование инсердионных мутантов.
3.3.2. Устойчивость мутантов к солевому и осмотическому стрессу
3.3.3. Поглощение калия клетками ЗупесИосузИя
3.3.4. Обсуждение.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Вовторых, в среде повышаются концентрации неорганических ионов, особенно и С Г, что приводит к ионному прессу. К началу наших исследований было установлено, что основную роль в процессе солеадаптации клеток i , играет накопление осмопротектора гликозилглицерина ГГ , . Роль других систем, в том числе, систем ионного транспорта, в адаптивном ответе клеток i на солевой стресс была практически не изучена. Диссертация посвящена изучению молекулярных механизмов и генетического контроля процессов, обеспечивающих устойчивость к солевому стрессу клеток цианобактерии i . i по генам, кодирующим субъединицы транспортирующих систем, и изучить роль систем поглощения К в ответе клеток i на солевой и осмотический стресс. Цианобактерии это прокариотические фотоавтотрофные организмы, получившие широкое распространение в ходе эволюции. Спектр их обитания включает в себя практически все водные экосистемы пресные и соленые, почвенную и даже воздушную среды. Такое разнообразие сред обитания цианобактерий обусловлено наличием различных механизмов адаптации к неблагоприятным, а зачастую экстремальным, условиям окружающей среды. Как и все живые клетки, цианобактерии открытые системы, взаимодействующие с окружающей средой. Одним из важнейших абиотических факторов в водном биотопе является соленость , . При повышении концентрации соли в среде клетки испытывают сразу два типа стрессовых воздействий. Вопервых, уменьшается водный потенциал, что приводит к быстрой потере клетками воды, и, как следствие, к уменьшению тургорного давления осмотический стресс . , , . Вода диффундирует через липидный бислой и через специфические водные каналы аквапорины , . Вовторых, в среде повышаются концентрации неорганических ионов, особенно и СГ ионный стресс , . Они поступают в клетку по химическому или электрохимическому градиенту, компенсируя, таким образом, потерю воды за счет уменьшения разности осмотических потенциалов. Однако неорганические ионы в высокой концентрации токсичны для клетки и мешают нормальному клеточному метаболизму , . В процессе адаптации к солевому стрессу клетка вытесняет избыток неорганических ионов, накапливает осмопротекторы, и синтезирует стрессовые белки , I . Vii , i . Одним из эффективных механизмов солеадаптацпи является накопление осмопротекторов. Осмопротекторы это низкомолекулярные гидрофильные соединения, которые аккумулируются в больших количествах в клетках, подвергнутых солевому стрессу. Внутриклеточные концентрации осмоггротекторов напрямую зависят от мощности стрессового воздействия , , . К осмопротекторам относятся аминокислоты и их производные глутамат, пролин, пролинбетаин, ацетилированные диаминокислоты, ацетилглутаминилглугамин амид, метиламины и их сульфонивые аналоги глицинбетаин, карнитин, диметилсульфониум пропионат, многоатомные спирты и их производные глицерин, гликозилглицерин, дисахариды сахароза, трегалоза и тетрагидропиримидины эктоин. Некоторые исследователи относят калий к осмопротекгорам , . Эти вещества, в основном, не участвуют в клеточном метаболизме, не влияют на репликацию ДНК и ДНКбелковые взаимодействия, потому что, как правило, инертны и не несут никакого заряда при физиологических значениях . , . Они уменьшают осмотический потенциал цитоплазмы, предотвращая дальнейшую потерю воды . Нате . Природа этой защиты еще до конца не изучена, но согласно одной из моделей, осмопротекторы окружают белки, непосредственно с ними не взаимодействуя. При этом водная оболочка вокруг белка сохраняется, и, соответственно, гидратный статус белка в условиях солевого сгресса не изменяется , , . Нейтральные осмопротекторы более предпочтительны для стабилизации белков.