Анализ сегрегации хромосом межвидовых гибридов, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток Mus musculus и спленоцитов Mus caroli

• Автор: Темирова, Сымбат Акбагышовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 109 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гибриды соматических клеток и их выделение

1.2. Сегрегация хромосом в гибридах соматических клеток.

1.2.1. Предполагаемые механизмы сегрегации хромосом в гибридах соматических клеток.

1.3. Гибридные клетки, полученные от слияния эмбриональных стволовых и соматических клеток
1.3.1. Сегрегация хромосом в клеточных гибридах, полученных слиянием эмбриональных стволовых и соматических клеток
1.4. Цитогенетические методы идентификации родительских хромосом в клеточных гибридах.
1.4.1. Дифференциальное окрашивание хромосом.
1.4.2. Методы i i гибридизации.
1.4.3. Исследование клеточных гибридов и химерных мышей с помощью цитогенетических методов.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Клеточные линии .
2.1.2. ДНК пробы.
2.2. Методы
2.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом
2.2.3. дифференциальное окрашивание метафазных хромосом
2.2.4. Биотинилирование зондов.
2.2.5. I с видоспецифичными зондами, мечеными биотином
2.2.6. III с геномной ДНК М. i
2.2.7. Двухцветная I с видоспецифичным и хромосомоспсцифичным зондами
2.2.8. I с хромосомоспецифичным зондом на хромосому
2.2.9. Микроскопирование и обработка изображений.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Анализ кариотипа ЭС клеток родительской линии НМ1
3.2. Исследование динамики числа хромосом в клеточных гибридах типа ЭСЭС.
3.3. ЦИТОГЕ ЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛОНОВ МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК
3.3.1. Распределение числа хромосом в клетках гибридных клонов.
3.3.2. Анализ соотношения хромосом М. и М. i в гибридных клетках
3.3.3 Исследование сегрегации гомеологов хромосом 1, и X в клонах гибридных клеток.
3.3.3.1. Сегрегация Ххромосом.
3.3.3.2. Сегрегация гомеологов хромосомы 1.
3.3.3.3. Сегрегация гомеологов хромосомы
3.3.4. Анализ элиминации хромосомы М. в гибридных клетках.
3.3.5. Хромосомные перестройки в клонах гибридных клеток серии НМС.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Впервые попытка использовать высокий потенциал ЭС клеток для репрограммирования генома дифференцированных клеток была реализована в экспериментах по гибридизации ЭС клеток мыши со спленоцитами взрослых животных Матвеева и др. Гибриды типа ЭСспленоцит сохраняли пшорипотснтность на высоком уровне, вплоть до способности генерировать химерных животных vv . Высокие плюрипотентные свойства были также выявлены в гибридных клетках, полученных от слияния ЭС клеток мыши с тимоцитами . . i . Эти эксперименты показали, что потенциал ЭС клеток сохраняется в геноме гибридных клеток и индуцирует восстановление плюрипотентности генома дифференцированных клеток. Уникальным свойством гибридных клеток типа ЭСдифференцированная клетка является то, что в одном ядре совмещаются два генома с разной историей развития, то есть появляется возможность оценить роль цис и транс регуляторных факторов как в поддержании плюрипотентного статуса ЭС клеток, так и в рсирограммировании генома соматического партнера. Однако при этом необходимым условием является знание кариотииа гибридных клеток и его изменения в процессе культивирования i vi и реального соотношения родительских геномов. Между тем, до настоящего времени не были проведены детальные цитогенетические исследования гибридов, полученных от слияния ЭС и дифференцированных клеток. Имелись лишь противоречивые данные по серегации хромосом в гибридных клетках типа ЭСдифференцированная клетка. Согласно данным одних авторов . . i . ЭСдифференцированная клетка сохраняют тетраплоидный набор хромосом, появившийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то есть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. Однако по данным других авторов, полученных при цитогенетическом анализе гибридных клеток тина ЭСспленоцит, имеет место отчетливая преимущественная элиминация хромосом сшеноцитов vv . Матвеева и др. Серов и др. Сегрегацию хромосом в гибридных клетках, образовавшихся i viv от слияния незрелых клетокпредшественников гематопоэза с клетками печени, описали Вассилопоулус и Ванг с соавторами Vi . . Важно также подчеркнуть, что в последнее время все большее внимание исследователей привлекает спонтанное слияние клеток, то есть образование гибридных клеток в разных органах и тканях взрослого животного. Биологические свойства и кариотипы таких гибридных клеток мало исследованы, хотя и представляют несомненный интерес как для специалистов в области канцерогенеза, так и для тех, кто исследует потенции стволовых клеток i viv v . . Vi, , . . Следует отметить, что применение прямых цитогенетических мегодов для внутривидовых и межвидовых гибридов, полученных от близких видов, затруднено изза морфологического сходства гомологичных хромосом. Таким образом, не вызывает сомнений актуальность цитогенетического исследования гибридных клеток типа ЭСдифференцированная клетка для установления реального соотношения родительских хромосом в гибридном геноме и их эволюции при культивировании i vi. Целью данной работы является цитогенетический анализ хромосомного состава набора клонов межвидовых гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток со сплсноцитами . Выбор азиатской мыши М. М. и М. М. и М. , , , , втретьих, . М. i имеют сходные, если не идентичные, кариотипы по числу и морфологии хромосом вчетвертых, имеется зонд, который позволяет дискриминировать центромеры хромосом М. М. i в гибридном геноме i . Исследовать кариотип ЭС клеток родительской линии НМ1 в ходе длительного культивирования i vi. Изучить хромосомный состав 6ти клонов гибридных клеток серии 3, полученных от слияния двух линий плюрипотентных ЭС клеток, 3 и 6. Провести детальный цитогенетический анализ ти клонов межвидовых гибридных клеток, полученных от слияния ЭС клеток М. М. i.