Проявление родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ДИ- и тетраплоидными фибробластами

• Автор: Круглова, Анна Александровна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

1ИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гибридизация клеток как способ изучения взаимодействия геномов

1.1.1. Гетерокарионы как модель изучения взаимодействий ядер разного типа

1.1.2. Гибридные клетки как модель изучения взаимодействия объединенных геномов

1.1.3. Соматические гибридные клетки, полученные при слиянии клеток с разной плоидностью
1.2. Свойства стволовых клеток эмбрионального происхождения и получение гибридных клеток между ними и соматическими клетками.

1.2.1. Характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения

1.2.2. Дифференцировка стволовых клеток эмбрионального происхождения i viv и i vi.
1.2.3. Гибридные клетки между соматическими и стволовыми клетками
1.2.4. Получение химерных животных с участием гибридных клеток ЭСКсоматичсская клетка как метод i viv оценки их потенциала.
1.2.5. Репрограммирование генома соматического партнера в гибридных клетках типа
ЭСК соматическая клетка.
1.3. Хромосомный состав гибридных клеток.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клетки и клеточные линии
2.2. Условия культивирования клеток
2.3. Получение и культивирование клеточных культур и гибридных клеток
2.3.1. Получение культур первичных эмбриональных фибробластов
2.3.2. Получение линии тетраплоидных фибробластов мыши.
2.3.3. Получение культуры фибробластов из органов и тканей взрослого животного
2.3.4. Получение гибридных клеток.
2.3.5. Культивирование эмбриональных стволовых клеток и клонов гибридных клеток типа ЭСКдиплоидные фибробласты.
2.3.6. Культивирование фибробластов и гибридных клеток ЭСКтетраплоидные
фибробласты
2.4. Анализ маркеров ЭСК в гибридных клетках.
2.4.1. Оценка активности щелочной фосфатазы.
2.4.2 Иммунофлуоресцентный анализ , 4, коллагена Iго типа и
фибронсктипа в ЭСК, фибробластах и гибридных клетках
2.4.3. Анализ экспрессии генов 4, , и с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени ПЦРРВ.
2.4.3.1. Выделение РНК
2.4.3.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени ПЦРРВ
2.5 Идентификация родительских хромосом в клонах гибридных клеток.
2.5.1. Анализ хромосомного состава с помощью микросателлитиых маркеров
2.5.1.1. Выделение ДНК
2.5.1.2. ПЦРанализ микросателлитиых маркеров.
2.5.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом и подсчет хромосом в клетках.
2.5.3. I i гибридизация с хромосомоспецифическими пробами.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1 Получение гибридных клеток типа ЭСКдиплоидные фибробласты
3.2. Хромосомный состав клонов типа ЭСКдиплоидные фибробласты
3.3.Характеристика гибридных клеток типа диплоидные ЭСКдиплоидные фибробласты.
3.4. Хромосомный и микросателлитный анализы клеточных культур, полученных из тканей химерных эмбрионов или взрослых химер
3.5. Фенотип гибридных клеток типа ЭСКтетраплоидные фибробласты
3.6. Хромосомный состав клонов типа ЭСКтетраплоидные фибробласты.
3.7. Анализ экспрессии маркерных генов ЭСК и фибробластов в гибридных клетках типа ЭСКтстраплоидиыс фибробласты
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ. Характеристика гибридных клеток типа диплоидные ЭСКдиплоидные фибробласты. Хромосомный состав клонов типа ЭСКтетраплоидные фибробласты. ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ. ПРИЛОЖЕНИЯ. Актуальность. Изучение природы такого свойства генома эмбриональных клеток, как плюрииотентность, является одной из важнейших задач современной биологии развития. Остаются не выясненными механизмы контроля над поддержанием или утратой илюрипотентности в ходе эмбрионального развития. Кроме этого, оставались не выясненными масштабы изменения генома плюрипотентной клетки при дифференцировке и возможность обратимости данных изменений. К настоящему времени разработано несколько экспериментальных подходов к репрограммированию соматического генома до плюрипотеитного уровня. Например, с помощью переноса ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит или оплодотворенную яйцеклетку i i, i . ЭСК с соматическими клетками взрослого животного Матвеева и др. Такие гибридные клетки обладают всеми свойствами эмбриональных стволовых клеток, не зависимо от того, какие соматические клетки участвовали в слиянии . Высокий потенциал гибридных клеток типа ЭСКсоматическая клетка подразумевает доминирование илюрипотентности ключевого свойства ЭСК. В основе доминирования лежит репрограммирование генома соматического партнера. Свидетельства репрограммирования аллелей соматического партнера для целого ряда генов были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭСК i и тимоцитов М. Прямые доказательства масштабного репрограммирования генома соматического партнера фибробласта и связанного с этим изменения профиля экспрессирующихся генов свыше по типу ЭСК были получены с помощью микрочиповой технологии при анализе гибридов ЭСК человека с фибробластами . Сохранение стабильного кариотипа при длительном культивировании ЭСК и их шнорипотентный потенциал делает модель гибридных клеток, полученных при участии ЭСК и соматических клеток, привлекательной для изучения репрограммирования и свойств полученных гибридных клеток. Однако при этом следует особо отметить, что для изучения возможных молекулярных механизмов поддержания плюрипотентности в гибридном геноме и репрограммировапия генома соматического партнера, необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток, поскольку данные о хромосомном составе гибридных клеток носят противоречивый характер. Согласно данным одних авторов . ЭСКдиффсрснцированные клетки сохраняют тетраплоидный набор хромосом, появившийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то есть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. По данным других авторов, полученным при цитогенетическом анализе гибридных клеток типа ЭСКспленоциты, имеет место отчетливая преимущественная элиминация хромосом спленоцитов vv . Матвеева и др. Серов и др. Пристяжшок и др. В связи с этим актуальность полноценного анализа хромосомного состава гибридных клеток, который позволит избежать ошибок в интерпретации масштабов рсиро1раммирования, трудно переоцени ть. Одним из наиболее адекватных способов оценки потенциала плюрипотентных клеток является получение химерных животных при введении клеток в полость бластоцисты. Исследование химерных животных, полученных введением тстраплоидных гибридных клеток в реципиентные бластоцисты, показало лишь незначительный вклад гибридных клеток в органы и ткани химерного животного . Имеются сообщения о рождении двух химерных животных, полученных при введении околотетраплоидных плюрипотентных клеток, однако необходимо отмстить, что в данных работах нет доказательств получения химерных животных именно из таких клеток, так же как и доказательств сохранения исходного кариотипа клеток при развитии химерного животного i . Таким образом, в данной работе впервые будет проведен анализ хромосомного состава потомков околотетранлоидных гибридных клеток, давших вклад в органы и ткани химерного животного, что позволит однозначно ответить на вопрос, связан ли плюри потентный потенциал вводимых гибридных клеток с репрофаммированием дифференцированных хромосом или с их утерей.