Изучение генетического разнообразия и анализ генома ВИЧ-1 в странах бывшего СССР

• Автор: Машарский, Алексей Эльвинович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 207 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика эпидемии ВИЧСПИД в мире

1.2. Структура генома ВИЧ1 и вирусные белки

1.3. Генетическое разнообразие ВИЧ

1.3.1. Мутационная изменчивость генома ВИЧ

1.3.2. Рекомбинационная изменчивость генома ВИ.

1.4. Филогенетическая классификация штаммов ВИЧ1.

1.4.1. История развития филогенетической классификации ВИ1.

1.4.2. Современная филогенетическая классификация В1Г.

1.5. Методы определения генетического разнообразия и субтинов ВИЧ1.

1.5.1. Секвенирование амтифицироваиных фрагментов генома ВИЧ1, полученных методом полимеразной цепной реакции
1.5.2. Секвенирование полноразмерных геномов ВИЧ
1.6. Молекулярная эпидемиология ВИЧ1.
1.6.1. Молекулярная эпидемиология ВИЧ1 в мире
1.6.2. Молекулярная эпидемиология I в странах бывшего СССР
1.7. Фенотипические свойства штаммов ВИЧ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Образцы крови
2.2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови.
2.3. Методы очистки ДК
2.3.1. Выделение ДНК из мононуклеарных клеток периферической крови
2.3.2. Выделение ичазмидной ДНК из клеток . i.
2.3.3. Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы.
2.4. Стратегия аплнфицироваиия фрагментов генома ВИЧ1 из ДНК ВИЧинфицированных пациентов
2.5. Реакции ферментативной модификации ДНК.
2.5.1. Полимеразная цепная реакция
2.5.2. Реакция лигирования фрагментов ДНК.
2.5.3. Реакция рестрикции плазмидной ДНК
2.5.4. Реакция ферментативного секвенирования ДНК.
2.6. Методы электрофореза ДНК.
2.6.1. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле
2.6.2. Препаративный электрофорез ДНК в легкоплавкой агарозе
2.6.3. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле.
2.7. Микробиологические методы
2.7.1. Приготовление компетентных клеток . i для трансформации.
2.7.2. Трансформация клеток . i.
2.8. Компьютерные методы анализа данных.
2.8.1. Первичный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.
2.8.2. Филогенетический аначиз нуклеотидных последовательностей ВИЧ1
2.8.3. Анализ функциональных элементов в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях ВИЧ
2.8.4. Статистический аначиз полученных результатов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Изучение генетического разнообразия ВИЧ
3.1.1. Результаты амплифицированияучастков генов v и ВИЧ
3.1.2. Результаты секвенирования участков генов v и ВИЧ1.
3.1.3. Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участков генов v и ВИЧ
3.1.4. Результаты анализа аминокислотных последовательностей.
кодируемых участками генов v и I .
3.1.5. Результаты филогенетического аначиза нуклеотидных последовательностей участков генов v и В I .
3.2. Клонирование и секвестрование полноразмерного генома штаммов ВИЧ1
3.2.1. Результаты ампчифицирования, клонирования и секвенирования фрагментов ДНК. содержащих в совокупности полный геном ВИЧ1
3.2.2. Результаты сравнительного аначиза нуклеотидных последовательностей молекулярных клонов фрагментов генома 1I1.
3.2.3. Реконструкция полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома штаммов ВИЧ
3.3. Анализ полноразмерного генома ВИЧ1.
3.3.1. Результаты аначиза функциональных элементов генома ВИЧ
3.3.2. Результаты филогенетического аначиза полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома ВИЧ
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
4.1. Генетическое разнообразие ВИЧ1 в странах бывшего СССР
4.2. Клонирование и секвенирование полноразмерного генома вариантов
ВИЧ1, доминирующих в странах бывшего СССР
4.3. Филогенетический анализ доминирующих в странах бывшего СССР
вариантов ВИЧ1.
4.4. Характерные особенности вариантов ВИЧ1, доминирующих в странах
бывшего СССР
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ II.
ПРИЛОЖЕНИЕ Ш
ПРИЛОЖЕНИЕ IV.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
3 ii В ii i i1 i3
фермент, редактирующий мРНК анолипопротеина В
ii i циркулирующая рекомбинантная
дцРНКаденозиндезаминаза
vi i страны бывшего СССР
IV iii vi вирус иммунодефицита человека
НМА x ii гстсродуплексныЙ анализ
i длинный концевой повтор
iv элемент негативной регуляции
i натрийфосфатный буфер 0 мМ ,
мМ 7.
2 iv ii
IV ii iii vi вирус иммунодефицита обезьян
ТАЕ мМ трисацетат, 2 мМ ЭДТА 8.
ivi
ТВЕ мМ трисборат, мМ борная кислота, 2 мМ ЭДГА 8.
I i i i IVI объединенная
программа Организации Объединенных Наций по ВИЧСПИД
урацилДНКгликозидаза
X 5бромо4хлоро3индолилргалактопиранозид
ак аминокислота
БСА бычий сывороточный альбумин
ВИЧ вирус иммунодефицита человека
дАТФ дезоксиадснозин трифосфат
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ дезоксинуклеознд трифосфат
дТТФ дезокситимидин трифосфат
дУТФ дезоксиуридин трифосфат
дцРНК двуцепочечная РНК
дЦТФ дезоксицитидин трифосфат
иптг изопропилртиогалактопиранозид
ИФА иммуноферментный анализ
кДа килодальтон
МКПК мононуклеарные клетки периферической крови
мРНК матричная РНК
п.н. пара нуклеотидов
ПИН потребители инъекционных наркотиков
ГЦР полимеразная цепная реакция
РНК рибонукл си новая кислота
спид синдром приобретенного иммунодефицита
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
трис трисгидрокиметиламинометан
тРНК транспортная РНК
УФ ультрафиолет
ЦРФ циркулирующая рекомбинантная форма
ЦТ Л цитотоксические Тлимфоциты
ЭДТА этилендиаминотетраацетат
Однобуквенные обозначения аминокислот
А аланин м метионин
С цистеин аспарагин
Б аспарагиновая кислота Р пролин
Е глутаминовая кислота Я аргинин
Р фенилаланин глутамин
в глицин Б серии
Н гистидин Т треонин
I изолейции V валин
К лизин триптофан
ь лейцин У тирозин
ВВЕДЕНИЕ


Этот сдвиг обусловлен наличием высоко консервативного гептамера и шпилечной вторичной структуры в вирусной РНК, и его частота не превышает 1 на актов трансляции . Процессинг белка начинается с самоотщепления вирусной протеазы молекулярный вес кДа, которая затем освобождает все остальные вирусные белки. Протсаза ВИЧ1 относится к классу аспартатных протеаз и расщепляет полипротеин в 9 местах, приводя к образованию зрелых структурных белков и ферментов 7. Таким образом, протсаза ВИЧ1 играет очень важную роль в образовании зрелого вириона и, следовательно, процессе репликации. Поэтому ингибиторы протеазы ВИЧ1 используются в качестве лекарств против СПИДа 2. Обратная транскриптаза ВИЧ1 представляет собой РНК и ДНКзависимую ДНКполимеразу и является гетеродимерной молекулой, состоящей из двух субъединиц рбб 0 аминокислот и р 0 аминокислот. Белок р представляет собой укороченный белок рбб и не проявляет ферментативной активности, играя структурную роль. РНКазы Н, расщепляющий РЫК в составе РНКДНКгибридов в процессе обратной транскрипции 1. Ингибиторы обратной транскриптазы стали первыми применяться в качестве лекарственных средств 3. Фермент интеграза представляет собой белок из 8 аминокислот размером кДа. Интеграза катализирует расщепление ДНК клеткихозяина и соединение концов разрыва с концами ДНК провируса. Благодаря тому, что интеграза распознается импортинкариофериновым комплексом клеткихозяина и транспортируется в ядро, ВИЧ, в отличие от многих других ретровирусов, способен встраивать провирусную ДНК в хромосомы непролиферирующих клеток 4. Ген епу ВИЧ1 кодирует белок длиной около 0 аминокислот. После отщепления лидериой последовательности в ходе процессинга белка и гликозилирования полипептида образуется гликопротеиниредшественннк 0. Связанные с мембраной шероховатого эндоплазматического ретикулума молекулы р0 образуют тримеры , которые в дальнейшем поступают в аппарат Гольджи, где бр0, подвергаясь расщеплению клеточными протеазами, образует 2 гликопротеина р0 поверхностный гликопротеин оболочки вируса и трансмембранный гликопротсин 6. Гликопротеин удерживается на поверхности клеточной мембраны нековалентными взаимодействиями с р. Гликопротеин р0 ВИЧ1 играет ключевую роль в прикреплении вируса к поверхности инфицируемой клетки. Основная функция при прикреплении вируса к клетке состоит во взаимодействии с гликопротеином клеточной поверхности СВ4 0, а также с хемокиновыми рецепторами. Рхемокинов, расположенные на поверхности инфицируемых Склеток 5,6. При этом связывание с Срецептором приводит к таким изменениям в конформации , которые необходимы для образования иили открытия сайта связывания хемокиновых рецепторов . Взаимодействие с 4 и корецепторами вызывает дополнительные конформационные изменения и , в результате которых освобождается гидрофобный концевой домен , проникающий в мембрану заражаемой клетки и обеспечивающий слияние мембран 3. Структура гликопротеина поддерживается консервативными аминокислотными остатками цистеина, принимающими участие в образовании дисульфидных мостиков 6. Участки, ограниченные дисульфидными мостиками, образуют петли, выступающие над поверхностью белковой глобулы. При сравнении аминокислотных последовательностей гликопротеииа разных штаммов ВИЧ1 в его составе были обнаружены пять вариабельных участков, обозначаемых VIV5, ограниченных пятыо консервативными участками С1С5 3,4. Различные участки гликопротеина отвечают за основные его функции связывание с 4, корецепторами, . Наибольшего внимания заслуживает третий вариабельный участок , называемый УЗпетлей, поскольку он играет важную роль в жизненном цикле вируса и его взаимоотношении с иммунной системой человеческого организма. Первоначально УЗпстля привлекла внимание исследователей как основной эпитоп для нейтрализующих антител 7,9, а также как сайт связывания для Тклеточных рецепторов 0. Помимо этого УЗпетля определяет такие биологические свойства вируса, как клеточный тропизм и цитопатическое действие, поскольку непосредственно участвует в процессе слияния вируса и клетки, взаимодействуя с корецепторами 0,6,7. Этому вопросу будет посвящен п.