Молекулярно-цитогенетический анализ эволюции хромосом полевок группы "arvalis" рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia)

• Автор: Рубцова, Надежда Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 146 с. : ил

Работа была выполнена на базе двух лабораторий Института цитологии и генетики СО РАН: лаборатории биохимической генетики животных и лаборатории морфологии и функции клеточных структур.
Автор выражает благодарность сотрудникам института, принимавшим участие в выполнении экспериментальной части работы: д.б.н. Н.Б. Рубцову, к.б.н. Т.В. Карамышевой, к.б.н. H.A. Мазурок, A.A. Исаенко, к.б.н. Н.В. Воробьевой,
Н.А. Сердюковой, к.б.н. А.И. Шевченко.
Автор признателен заведующему лаборатории морфологии и функции клеточных структур д.б.н. Н.Б. Рубцову за участие в обсуждении полученных результатов и подготовке ряда публикаций, заведующему лаборатории биохимической генетики животных д.б.н. С.М. Закияну за долготерпение при написании и оформлении диссертации.
ОГЛАВЛЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Некоторые аспекты организации и эволюции генома млекопитающих
1.2. Гетерохроматиновые районы в хромосомах млекопитающих
1.2.1. Конститутивный гетерохроматин
1.2.2. Центромерные районы
1.2.3. Теломерные районы
1.2.4. Ядрышкообразующие районы
1.3. Повторяющиеся последовательности ДНК и хромосомные перестройки
1.3.1. Мобильные элементы
1.3.2. Интерстициальные теломерные повторы
1.3.3. Сегментные дупликации
1.4. Эволюционная консервативность Х-хромосомы млекопитающих
1.5. Микродисекционные ДНК-пробы в хромосомном пэйнтинге
1.6. Группа обыкновенных полевок рода Microtus (отряд Rodentia)
1.6.1. Систематическое положение и филогенетические отношения
внутри группы
1.6.2. Кариологические характеристики обыкновенных полевок
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Животные
2.2. Получение культур первичных фибробластов легких
2.3. Фиксация клеток
2.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом
2.5. Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом
2.5.1. GTG-дифференциальное окрашивание хромосом
2.5.2. Ag-окрашивание
2.5.3. Последовательное окрашивание хромосом разными методами
2.5.4. С-дифференциальное окрашивание
2.5.5. GTG-окрашивание хромосом для микродиссекции
2.6. Получение микродиссекционных ДНК-проб
2.7. Введение метки в ДНК микродиссекционных ДНК-проб
2.8. ДНК-проба для детекции рДНК
2.9. Флуоресцентная in situ гибридизация
2.9.1. Супрессионная in situ гибридизация
2.10. Детекция на цитологических препаратах меченых ДНК-проб
2.10.1. Детекция ДНК-проб, меченных биотин- 16-дУТФ
2.10.2. Детекция ДНК-проб, меченых дигоксигенин-11-дУТФ
2.10.3. Совместное выявление двух гаптен-меченых ДНК-проб
2.11. Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Локализация ядрышкообразующих районов в хромосомах
обыкновенных полевок
3.1.1. Локализация ЯО-районов с применением Ag-окрашивания хромосом
3.1.2. Локализация генов рибосомных РНКс применением FISH
3.1.3. Сравнение хромосомной локализации ЯО-районов у разных видов
3.2. Анализ реорганизации гомологов хромосом 5 и 8 М. arvalis "obscurus" при формировании дополнительных блоков гетерохроматина и
в процессе эволюции видов
3.2.1. Характеристика дополнительных блоков гетерохроматина перестроенных гомологов хромосом 5 и 8 М. arvalis "obscurus"
3.2.2. Районоспецифические ДНК-пробы хромосом M.arvalis «obscurus»
3.2.3. CISS-гибридизация ДНК-проб гетерохроматиновых блоков 5КС и 8КС
3.2.4. Сравнение организации эухроматиновых районов хромосом 8, 8я M.arvalis «obscurus» и их гомеологов
3.2.5. Сравнение организации эухроматиновых районов хромосом
5 и 5rM.arvalis "obscurus"
3.2.6. Сравнение организации эухроматиновых районов хромосомы
M.arvalis "obscurus" и ее гомеологов
3.3. Распределение в хромосомах полевок подрода Microtus кластеров повторяющихся последовательностей ДНК, выявленных
в разных вариантах FISH
3.3.1. CISS-гибридизация ДНК-проб гетерохроматинового блока 5КС

на метафазных хромосомах их, как правило, нельзя отличить от собственно теломерных повторов. Для их выявления используют секвенирование прителомерных последовательностей ДНК (Chute et al., 1997; Flint et al., 1997; Azzalin et al., 2001). Кроме того, небольшие по размеру интеркалярно расположенные Its, могут остаться за пределами чувствительности метода in situ гибридизации. Поэтому общее количество Its в геноме млекопитающих может значительно превосходить то, что удается обнаружить в метафазных хромосомах с помощью FISH.
По одной из гипотез, интерстициальные теломеры возникли в процессе эволюции в результате хромосомных слияний и представляют собой остаток теломер предковых хромосом, принимавших участие в перестройке (Hastie, Allshire, 1989; Meyne et al., 1990). Результаты анализа хромосом у представителей некоторых отрядов млекопитающих вполне согласуется с таким предположением (Lee et al., 1993; Vermeesch et al., 1996; Metcalfe et al., 1997,1998; 2000). Однако во многих случаях при анализе метафазных хромосом с использованием FISH в точках эволюционных слияний не удалось обнаружить присутствие теломерных повторов (Schubert et al., 1992; Garanga et al., 1995; Nanda et al., 1995; Qumsiyev et al., 1997). Подобное противоречие объясняют либо наличием разных механизмов слияния в разных эволюционных ветвях, либо потерей оставшихся после слияния теломерных повторов в процессе длительной независимой эволюции.
Анализ молекулярной структуры Its в хромосомах человека показал, что не всегда наличие интерстициальных теломер можно объяснить, основываясь на предположении о слиянии хромосом. На сегодня обнаружено только два сайта (2ql3 и lq41), в которых молекулярная структура Its согласуется с этой гипотезой (Azzalin et al., 2001). Был предложен иной механизм возникновения Its, в соответствии с которым они возникают как результат сшивания двунитевых разрывов в хромосомах. В одних случаях устранение подобных разрывов может осуществляться теломеразой, в других - без участия этого фермента. В последнем варианте встраивание фрагментов теломерных повторов в место разрыва может происходить по типу ретроэлементов (Slijepcevic, Bryant, 1998; Azzalin et al., 2001).