Фенотипическая изменчивость в популяции клеток Escherichia coli, содержащих циклические дигенные системы

• Автор: Ступак, Игорь Валериевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 109 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Теоретикоэкспериментальные аспекты изучения эпигенных систем

1.2. Генные сети

1.2.1. Конструирование искусственных генных сетей.

1.2.2. Организация генной регуляторной сети . i.

1.2.3. Функциональногенетическая изменчивость генных сетей.

1.3. Физиологогенетические механизмы адаптивной изменчивости

1.3.1. Системы ответа бактериальных клеток на стресс

1.3.2. Системы программируемой клеточной смерти у прокариот.

1.3.3. Система коллективного выживания у бактерий.
1.4. Молекулярные механизмы адаптивного мутагенеза прокариот
1.4.1. Точковые мутации, как результат адаптивной изменчивости
1.4.2. Адаптивные изменения в структурнофункциональной организации хромосом.
1.4.3. Закрепление результатов адаптивного мутагенеза в эволюции
1.4.4. Адаптивные механизмы преодоления межвидовых генетических барьеров
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Объект исследования
2.2. Среда и условия роста
2.3. Выявление клеток, синтезирующих галактозидазу
2.4. Определение относительной концентрации белка в клетках
2.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.6. Трансформация клеток .i
2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.
2.8. Лигирование фрагментов ДНК.
2.9. Расщепление одноцепочечных участков ДНК нуклеазой 1
2.8. Электрофорез в агарозном геле
2.9. Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы.
2 Статистический анализ.
2 Штаммы .i и плазмиды
2 Ферменты
2 Реактивы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конструирование плазмидных циклических дигенных сетей
с отрицательными обратными связями
3.2. Изучение функциональной активности циклических дигенных систем путем рассева до единичных колоний.
3.3. Экспериментальное моделирование дупликаций, изменяющих функциональную активность циклической дигенной системы
3.4. Влияние аминокислотного голодания на работу циклической дигенной
системы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Одним из механизмов эпигенетической изменчивости является наследование признаков, основанное на регуляторных взаимодействиях в циклических генных сетях. Гипотеза о существовании эпигенов особых наследственных единиц, имеющих не менее двух режимов функционирования подчиннных им генов, способных сохранять каждый из режимов в последовательном ряду поколений, была выдвинута в году Чураев, . Существование эпигенов как наследственных единиц следующего уровня сложности, чем гены, было доказано в рамках теоретической математической модели системы управления онтогенезом общего вида v, . Так же было показано наличие бистабильных генетических модулей, имеющих свойства эпигенов v, в генных сетях, управляющих ранним развитием i. Одним из классов эпигенов являются циклические системы генов. Экспериментальное изучение функционирования искусственных циклических дигенных систем с отрицательными обратными связями ЦДС в клетке, позволяет расширить представление об особенностях эпигенетической изменчивости и оценить влияние внешних и внутренних факторов на устойчивость наследования альтернативных фенотипических состояний. Цель работы изучение функционирования ЦДС в клетках ii i, по фенотипическим изменениям в бактериальных популяциях, подвергшихся действию различных индуцирующих факторов. Конструирование ЦЦС, содержащей ген под контролем промотора и ген с7 термочувствительного репрессора бактериофага под контролем промотора Рас. Экспериментальное тестирование ожидаемых функциональных свойств полученной рекомбинантной плазмиды. Сравнение свойств ЦЦС, отличающихся особенностями регуляторных районов или областями репликации плазмид носителей. Исследование функционирования ЦЦС в составе трхгенной системы. Исследование устойчивости режимов работы ЦЦС к стрессовым воздействиям среды. ДНКпоследовательностей, входящих в систему генов. Исследовано наследование и переключение фенотипов бактериальных клеток, содержащих ЦДС, в процессе роста колонии на индикаторной среде в постоянных условиях. Впервые показана зависимость функционирования ЦЦС от области репликации плазмиды носителя. Результаты исследования способствуют пониманию возможной роли ЦЦС в эпигенетической изменчивости, как структуры, реагирующей на внешние временные сигнальные воздействия переключением регуляторных режимов функционирования генов. В связи с этим, большое значение приобретает изучение взаимодействия бистабильных модулей клеточной памяти с регуляторными системами клетки. Также ЦДС могут быть использованы для управляемого биосинтеза и контроля клеточного роста в биотехнологии. Принимая во внимание, что такие генетические системы по существу представляют ячейку памяти, способную запоминать двоичные сигналы, в дальнейшем возможно использование ЦДС для создания искусственной генной памяти систем управления онтогенезом клетки, а также в генной терапии для адресного воздействия и включения компенсаторных генов в нужный момент при лечении наследственных заболеваний. Результаты исследования были представлены на II СанктПетербург, и III Москва, съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 9 и Пущинской школыконференции молодых ученых Биология наука XXI века Пущино, , международной научной конференции Молекулярная генетика, геномика и биотехнология Минск, . По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Работа изложена на 9 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 4 источников работ отечественных и 7 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами, 4 схемами, 7 диаграммами и фотографиями. Считаю своей приятной обязанностью выразить признательность моему научному руководителю д. Чураеву Р. Н., сотрудникам лаборатории математической и молекулярной генетики м. Ступак Е. Э., к. Галимзянову . ., к. Галимзяновой Н. Ф., к. Миграновой И. Г., сотрудникам института Органической химии к. Астахову С. С., к. Алябьеву .