Регуляторные районы контролируемых глюкокортикоидами генов : Экспериментальное и теоретическое исследование

• Автор: Меркулова, Татьяна Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 271 с. : ил

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ

2.1. Тены, регулируемые глюкокортикоидами.

2.2. Структурнофункциональная организация рецептора глюкокортикоидов

2.2.1. Гормонсвязывающий домен

2.2.2. ДИК связывающий домен

2.2.3. Районы ГР, ответственные за трансактиваторную функцию

2.3. Цитоплазматический мультибелковый комплекс, активация и переход в клеточное ядро
2.4. Элементы глюкокортикоидной регуляции СКЕб и связанные с ними способы позитивного и негативного контроля транскрипции генов глюкокортикоидными гормонами.

2.4.1.1 озитивнье элементы глюкокортикоидной регуляции Классические .

2.4.2. Негативные элементы глюкокортикоидной регуляции пОКЕя

2.4.3. Композиционные элементы, обеспечивающие негативную гл юко корги ко и дну ю ре гул я цию.
2.4.4. Опосредованные элементы негативной глюкокортикоидной регуляции
2.4.5. Позитивные элементы задержанного первичного ответа на глюкокортикоидные гормоны.
2.5. Регуляторные зоны контролируемых глюкокортикоидами генов. Единицы глюкокортикоидной регуляции Ския.
2.6. Возможные механизмы регуляции транскрипции глюкокортикоидами
2.7. Взаимодействие рецептора глюкокортикоидов с ДНК,
упакованной в нуклеосомы влияние на специфичность
связывания и инициация ремоделирования хроматина.
2.8. Механизмы, обеспечивающие специфичность регуляции экспрессии генов стероидными гормонами.
2.9. Заключение по обзору литературы
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы, использованные в работе
3.2. Олигонуклеотиды
3.3. Рекомбинантные ДНК
3.4. Животные
3.5. Приготовление цитозоля печени крыс
3.6. Очистка рецептора глюкокортикоидов из печени крыс
3.7. Определение специфического связывания глюкокортикоидрецем торного комплекса ГлРК с ДНК
3.7.1. Метод торможения ДКпробы в геле
3.7.1. Задержка комплексов ГлРКДПК на нигроцеллюлозных фильтрах
3.7.2. Осаждение связанной с ГлРК ДНК в комплексе с моноклональными антителами
3.7.4. Конкуренция исследуемой ДНК с ДНКцеллюлозой за
связывание с ГлРК
3.8. Приготовление цитозоля печени мышей, определение
гормонсвязывающей и ДКсвязывающей активности рецептора глюкокортикоидов
3.9. Получение экстракта ядер клеток печени
3 Рстардационный анализ с использованием белков экстракта ядер
3 Временные трансфекции
3 Определение активности хлорамфениколацетилтраисферазы
3 Выделение РНК и озернблотгибридизация.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Первичная структура сайта связывания глкжокортикоидного рецептора Влияние нуклеотидных последовательностей, фланкирующих консервативное гомологичное консенсусу ядро сайта, на эффективность связывания ГР.
4.2. Разработка нового метода поиска потенциальных сайтов связывания рецеп тора глюкокортикоидов в нуклеотидных последовательностях.
4.3. Экспериментальная проверка разработанного метода Выявление сайтов связывания рецептора глюкокортикоидов и функциональных . в генах цитохрома СУР2В2 крысы, мегаллогионеина I мыши и хорионического соматомамотропина человека.
4.4. Обнаружение участка специфического связывания рецептора глюкокортикоидов в районе го интронов гена
триптофандиоксигеназы и выявление в этом районе регуляторного элемента, изменения в нуклеотидной последовательности которого ассоциированы с рядом психических расстройств.
4.5. База данных транскрипционных регуляторных районов контролируемых глюкокортикоидами генов .
4.5.1. Содержание .
4.5.2. Выборка из и се использование для изучения закономерностей структурной организации этих элемен тов.
4.5.3. Анализ структурнофункциональной организации регуляторных районов контролируемых глюкокортикоидами генов на базе материалов СЯТЯНО.
4.6. Выяснение механизма ингибирующего влияния
гепатоканцерогенов на глюкокортикоидную индукцию тирозинаминотрансферазы ГА Г.
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. ВЫВОДЫ
8. СПИСОК ЦИТИРОВА1ШОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
I Р рецептор глюкокортикоидов
ГлРК глюкортикоидрецепторный комплекс
ii iv элемент глюкокортикоидной регуляции
iv ii iv элемент негативной глюкокортикоидной регуляции
ii iv i единица глюкокортикоидной регуляции
ii i элемент модулирующий действие глюкокортикоидов
iv элемент эстрогенной регуляции iv элемент андрогенной регуляции iv элемент прогестиновой регуляции iii iv элемент минералокортикоидной регуляции
iv элемент гормональной регуляции iv элемент, опосредующий регуляцию под действием цАМФ
ii i iv элемент, опосредующий регуляцию под действием ретиноевой кислоты
I ii iv элемент, опосредующий регуляцию под
действием инсулина
ТФ транскрипционный фактор
АР рецептор андрогенов
ПР рецептор прогестинов
МР рецептор минералокортикоидов
ii i, белок, связывающийся с
1 v 1, ядерный фактор гепатоцитов I.
3 3, ядерный фактор гспатоцитов З 4 4, ядерный фактор гспатоцитов 4 6 6, ядерный фактор гепатоцитов 6 С x ii i, белок, связывающийся с ССААГбоксом
i vi ii , транскрипционный фактор, связывающийся с промоторным районом гена овальбумина курицы
1ВР x ii i, бокс связывающая субъединица базального транскрипционного фактора II I iv i 1, активаторный белок 1 1, ядерный фактор
ii 1, транскрипционный фактор, связывающийся с октамерным мотивом
5 i iv ii 5, передатчик сигнала и активатор транскрипции
1 i 1, фактор транскрипции ИньЯнь
длинный концевой повтор
V вирус рака молочных желез мышей
ТАТ тирозинам и нотрансфераза
РЕРСК фосфоенолпируваткарбоксикиназа
триптофандиоксигеназа
аспаргатами нотрансфераза
МТ металлотионеин I
хорионический соматомаммотропин человека хлорамфениколацетилтрансфераза
i i i единичная нуклеотидная замена ОАТ ортоаминоазотолуол 3 МеДАБ 3 метил4диметиламиноазобензол
ПААГ полиакриламидный гель ДДС додецилсульфат натрия
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Вопервых, следует разделять первичную, не зависящую от белкового синтеза регуляцию, и вторичную регуляцию, требующую синтеза какихлибо белков v. Последний тип регуляции характеризуется чувствительностью к ингибиторам белкового синтеза, таким как циклогексимид, а также большим временным интервалом между введением гормона и первыми признаками его действия при вторичной регуляции зти интервалы достигают от нескольких часов до нескольких суток, тогда как при первичной они измеряются в минутах М. М., . Механизм первичной регуляции экспрессии генов глкжокорти кои дами заключается в связывании гормона со специальными внутриклеточными рецепторными белками рецепторы глкжокортикоидов ГР, которые либо непосредственно, либо через связывание с другими транскрипционными факторами взаимодействуют с регуляторными элементами ii iv геновмишеней, что приводит к быстрому изменению уровня транскрипции этих генов. По этому типу регулируется большое число контролируемых глюкокортикоидами генов гены гормона роста, проопиомеланокортина, пролактина, ангиотензина, интерлейкина6, киназы, металлотионеинов, фосфоенолпируваткарбоксикиназы, тирозин и аспартатаминотрансферазы, фенилаланингидроксилазы и многих других. Механизм вторичной регуляции включает в себя вызванный глюкокортикоидами посредством первичного механизма синтез регуляторных белковфакторов транскрипции, которые регулируют экспрессию не содержащих , и тем не менее, контролируемых глюкокортикоидами генов. Таким образом осуществляется, например, глкжокорти кои дная индукция генов аргиназы Т. Т. . В случае гена овальбумина такую же роль посредника в действии глюкокортикоидов выполняет лабильный фактор транскрипции iI , . Характер и первичной, и вторичной регуляции может быть как позитивным глкжокортикоидная индукция, так негативным угнетение экспрессии генов под действием глюкокортикоидов. Среди генов, регулируемых глюкокортикоидами но первичному пози тивному типу выделяют еще две особых группы гены задержанного первичного ответа на глюкокоргикоидные гормоны и гены быстрого ответа, но чувствительного к ингибиторам синтеза белка. В первую группу входят гены, повышение уровня транскрипции которых происходит в достаточно отдаленные от момента гормонального воздействия сроки более часов и требует синтеза некого нового белка. При этом для глюкокортикоидной индукции таких генов необходимо связывание рецептора глюкокортикоидов с их ДНК, что отличает гены задержанного первичного ответа от генов вторичного ответа, регулируемых глюкокортикоидами опосредованно лишь за счет активации синтеза иных регуляторных белков М. М., . В эту группу входят ген а2и глобулина крысы . Вторая группа представлена генами, кодирующими кислый гликопротеин у разных видов животных Т. В последние 2 десятилетия были достигнуты значительные успехи в изучении механизмов глюкокортикоидной регуляции. Осуществлены широкомасштабные исследования регуляторных районов контролируемых глюкокортикоидами генов. Проведено детальное изучение структурнофункциональной организации белка рецептора гл ю ко корти ко иди ы х гормонов. Белок рецептор глюкокортикоидных гормонов ГР принадлежит семейству рецепторов стероидныхТиреоидных гормонов, которое входит в суперсемейство внутриклеточных рецепторов. Все члены этого суперсемейства являются связывающимися с ДНК факторами транскрипции. Их ДНКсвязывающий домен характеризуется наличием двух петлевых структур, называемых цинковыми пальцами, в основании которых лежат четыре остатка цистеина, координированных, ионами цинка МагеЫоЦ ПЛ. Члены семейства имеют общий план строения и характеризуются достаточно высокой степенью гомологии Рис. В них выделяют три основных функциональных домена Сконцевой гормонсвязывающий, центральный ДНКсвязывающий и Мконцсвой активаторный иммуногенный. Гормонсвязывающий домен ГР включает в себя около 0 аминокислотных остатков ОашеЬеп М. Ковалентное мечение мест связывания лиганда выявило, что аминокислоты Мет0 Цис4 и Цис2 ГР мыши взаимодействуют со стероидом СагЫескОике Г а1. БткЬ Ы. Полипетидная цепь домена образует при этом широкую петлю, контактирующую с молекулой стероида с двух сторон.