Разработка и применение гибридизационных и ПЦР технологий для молекулярного анализа геномов микроорганизмов

• Автор: Щербо, Сергей Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 395 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ф Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы гибридизационного анализа нуклеиновых кислот.

1.2. Способы модификации ДНК различными гаптенами для проведения нерадиоизотопного гибридизационного

анализа нуклеиновых кислот.

1.2.1 ДНКзонды меченные биотином и дигоксигенином.

1.2.2. Фотомодифицирующие реагенты в гибридизационном

анализе нуклеиновых кислот.

1.2.3. Люминесцентные метки для введения в нуклеиновые кислоты.

1.3. Применение нерадиоиозтопного гибридизационного анализа для обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов и вирусов.
1.4. Способы пробоподготовки и условия проведения ПЦР
реакции.
1.4.1. Пробоподготовка.
1.4.2. Оптимизация условий проведения ПЦРреакции.
1.4.3. Подбор праймеров.
1.4.4.Термостабильная полимераза, дезоксинуклеотидтрифосфаты,
компоненты ПЦР буфера.
1.5. Разработка наборов реагентов для молекулярного анализа
Щ генома методом ПЦР.
1.5.1. Хламидия трахоматис.
1.5.2. Микоплазма гоминис и микоплазма гениталиум.
1.5.3. Уреаплазма уреалитикум.
1.5.4. Одновременное выявление некоторых микроорганизмов и вирусов методом ПЦР с использованием мультипраймерных
наборов реагентов.
1.6. Возможности метода ПЦР и других диагностических
подходов к анализу клиниических образцов.
1.6.1. Анализ герпесвирусов.
1.6.2. Гарднерелла вагиналис.
1.6.3 Трихомонада вагиналис.
1.6.4 Грибы рода кандида и трихофитон.
1.7. Разнообразие методов и актуальность унификации подходов молекулярного анализа геномов.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Методы нерадиоизотопного гибридизационного анализа .
2.2. Метод полимеразной цепной реакции.
2.2.1. Пробоподготовка клинических образцов.
2.2.1.1. Лизис клинических образцов.
2.2.1.2. Ускореная пробоподготовка.
2.2.1.3. Муколитический реагент.
2.2.1.4. Культивирование и выделение грибов.
2.2.2. Получение положительных контрольных образцов для набора реагентов для выявления кандида альбиканс.
2.2.3. Определение нуклеотидных последовательностей ПЦРпродуктов, полученных на клинических образцах М. ii, Т. vii.
2.2.4. Инструкция по применению набора реагентов для обнаружения ДНК микроорганизмов, вирусов и грибов методом ПЦР.
2.3. Клиниколабораторные методы обследования на присутствие
. vii и i .
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Разработка и оптимизация способов модификации ДНК биотином, производными платины, красителями, для проведения множественного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот.
3.1.1 Модификация ДНК дигидразидом янтарной кислоты
для получения гибридизационных зондов.
3.1.2. Получение полимерного фотобиотинилирующего реагента фотобиотина и его использование в гибридизационном
анализе нуклеиновых кислот.
3.1.3. Модификация ДНК комплексными соединениями
платины для получения гибридизационных зондов.
3.1.3.1.ТДЦПновая метка для ДНКзондов.
3.1.3.2.ЦДДП и диенП новые гаптены в нерадиоизотопном
гибридизационном анализе нуклеиновых кислот.
3.1.4. Множественный гибридизационный анализ с одновременным использованием нескольких ДНКзондов, несущих различные нерадиоизотопные метки.
3.1.5. Разработка эффективных и чувствительных методов детекции нерадиоизотопных гибридизационных ДНКзондов с использованием коллоидных частиц и полимерных маркеров.
3.1.6. Оптимизация свойств полиакролеиновых латексов для гибридизационного анализа.
3.1.6.1. Получение окрашенных полиакролеиновых латексов для нерадиоизотопного гибридизационного анализа.
3.1.6.2. Оптимизация спектральнолюминесцентных характеристик окрашенных полиакролеиновых латексов.
3.1.6.3. Получение конъюгата полиакролеиновых латексов со стрептавидином.
3.1.6.4. Выбор биотинилированных полинуклеотидных зондов для латексного гибридизационного анализа.
3.1.7. Нерадиоизотопный гибридизационный анализ нуклеиновых кислот с использованием окрашенных латексов.
Выводы раздела 3.1.
3.2. Разработка и совершенствование способов пробоподготовки,
условий проведения ПЦР и мультипраймерной ПЦН .
3.2.1. Пробоподготовка.
3.2.1.1. Лизис клинических образцов и ускоренная пробоподготовка.
3.2.1.2. Лиофилизованный набор для пробоподготовки.
3.2.1.3. Пробоподготовка при работе с мокротой
3.2.1.4. Разработка системы внутреннего контроля для оценки возможности ингибирования полимеразной цепной реакции.
3.2.2. Разработка на основе анализа геномов наборов реагентов для выявления возбудителей некоторых инфекций передаваемых
половым путем.
3.2.2.1 .Хламидия трахоматис.
3.2.2.2. Микоплазма гоминис и микоплазма гениталиум.
3.2.2.3. Уреаплазма уреалитикум.
3.2.3. Особенности подбора оптимальных условий для мультипраймерной ПЦР.
3.2.4. Разработка на основе анализа геномов мультипраймерных наборов реагентов для анализа некоторых урогенитальных инфекций.
3.2.4.1. Типирование вируса папилломы человека.
3.2.4.2. Герпесвирусы.
3.2.4.3. Хламидия трахоматис,микоплазмы и уреаплазмы.
Выводы раздела 3.2.
3.3. Сравнительное изучение метода ПЦР и других диагностических подходов к анализу различных биологических образцов.
3.3.1. Оценка и сравнение эффективности методов гибридизационного и ПЦРанализа для выявления в клинических образцах некоторых возбудителей ИППП.
3.3.2. Молекулярный анализ геномов некоторых герпесвирусов.
3.3.2.1. Вирус простого герпеса.
3.3.2.2.Цитомегаловирус.
3.3.3. Разработка оптимальных схем применения молекулярногенетических методов в клинической лабораторной диагностике.
3.3.3.1. Гарднерелла вагиналис, лактобациллы.
3.3.3.2. Трихомонас вагиналис.
3.3.4. Разработка на основе анализа геномов наборов реагентов для анализа ДНК некоторых видов грибов методом ПЦР.
3.3.4.1. Кандида альбиканс.
3.3.4.2. Трихофитон рубрум и трихофитон ментагрофитес.
Выводы раздела 3.3
3.4. Способ формирования набора компонентов для молекулярного анализа генома и его применение.
Выводы раздела 3.4.
ВЫВОДЫ ДИССЕРТАЦИИ.
ЛИТЕРАТУРА


Из образцов ЦМВ обнаружили в , причем 3 из них были положительными обоими методами, только ПЦР и 2 только культуральным методом. Положительные в ПЦР из или 9 из образцы детектировали соответственно с праймерами на НХЬЕ 4 или М1Е 1,при этом из ЮСЫ7 4 позитивных результатов детектировали с использованием дотблот или ОЕ1А гибридизации, и только 9 из при использовании гельэлектрофореза. Таким образом, наиболее чувствительным методом исследования ЦМВ в клинических образцах, по мнению авторов, является использование праймеров на НХЬЕ 4 ген в сочетании с дотблот или ЭЕ1А гибридизации. Разработан чувствительный и быстрый 6 часов метод дотблот НГА для детекции ЭБВ ДНК зонд напрямую был помечен щелочной фосфатазой, а образовавшийся гибрид проявляли хемилюминесцентным субстратом, который давал чувствительность 4 пг, что в раз выше, чем при применении субстратов, дающих цветовую реакцию. С использованием указанного метода и ПЦР получены положительные результаты для 9 клинических образцов больных с карциномой. Большое число работ посвящено разработке различных подходов к НГА ВПЧ . Шведскими авторами предложен метод типирования ВПЧ ДНК из клинического материала применяли в качестве биотинмеченного зонда, который получали методом амплификации и использовали в НГА на мембране с нанесенными ДНК ВПЧ разных типов. Исследовали клинических образца из цервикального канала женщин с положительной ПЦР реакцией использовали консенсусные праймеры для ВПЧ. Созданы наборы реагентов предназначенные для обнаружения в биопсийных гистологических препаратах ДНК ВПЧ различных типов, интегрированных в хромосомы инфицированных клеток. Способ обнаружения специфическая гибридизация фрагментов вирусного генома с олигонуклеотидными зондами, модифицированными биотином, с последующим присоединением к зондам комплекса СА и щелочной фосфатазы. Г.А. Франком с соавторами , адаптирована в клиническую практику методика проведения гибридизации i i. Установлена локализация ВГТЧ в железистом компоненте аденоплоскоклеточного рака и аденокарциномы шейки матки. Показано, что ДНК ВПЧ присутствует при папилломатозе в зонах с плоскоклеточным раком гортани, а не только в эпителиальной ткани. Впервые идентифицирована ДНК ВПЧ в материале больных с диагнозом переходноклеточный рак мочевого пузыря. Комплексное исследование матодами ПЦР и гибридизацией i i позволяет повысить эффективность выявления, локализации и типирования ДНК ВПЧ при опухолях шейки матки, гортани и мочевого пузыря. ВПЧ в ходе инфекционного цикла включают свой генетический материал в состав хромосомы инфицированной клетки и необходимо знать, какой тип вируса вызвал данную папиллому, так как в зависимости от этого используются разные протоколы лечения. Высокоонкогенными являются типы ВПЧ и , а тип 6 среднеонкогенным. В начале опухолевого процесса, вызванного ВПЧ, в человеческих хромосомах остаются только два гена ВПЧ вирусные онкогены Е6 и Е7, которые регистрируются набором МИКРОВИРУС ВПЧонко, что позволяет сделать вывод о переходе инфекционного процесса в опухолевый. С А и щелочной фосфатазы присоединяется к специфическому олигонуклеотидному зонду, модифицированному биотином и производится регистрация окрашенного продукта при помощи светового микроскопа. Разработка новых простых и доступных способов введения известных нерадиоизотопных меток в НК в том числе фотобиотинилирующих и получение наряду с биотином и дигоксигенином новых перспективных меток даст возможность шире применять множественный НГА в научных исследованииях и медицинской практике. В связи с этим несомненный интерес представляло разработать новые подходы к детекции образовавшихся гибридов. Использования для этих целей красителей, особенно флуоресцирующих, должно позволить не только упростить методику проявления, но и повысить чувствительность анализа. Способы пробоподготовки и условия проведения ПЦР реакции. Пробоподготовка. Для проведения МАГ, необходимо прежде всего получить НК в чистом виде. При выделении НК из клинических образцов соскоб, слюна, моча, сыворотка и плазма крови и т. НК.