Анализ функции гена RAD29/RDH54, контролирующего эксцизионную репарацию оснований у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Латыпов, Виталий Феликсович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 142 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.,

ГЛАВА 1. СИСТЕМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ ГЕНЕТИЧЕ

СКОГО МАТЕРИАЛА У ДРОЖЖЕЙ vii. Обзор литературы

1.1. Основные типы повреждений ДНК и пути их репарации

1.2. Типы взаимодействий между мутациями радиочувствительности. Эпистатические группы генов.

1.3. Эксцизионная репарация.

1.3.1. Эксцизионная репарация нуклеотидов эпистатическая группа 3

1.3.2. Эксцизионная репарация оснований.1.

1.3.3. Коррекция ошибочно спаренных оснований.

1.4. Рекомбинационная репарация эпистатическая группа

1.5. Пострепликативная репарация эпистатическая группа 6.
1.5.1. Репарация, склонная к ошибкам
1.5.2. Безошибочный путь пострепликативной репарации
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Основные штаммы и условия их культивирования.
2.1.1. Штаммы.
2.1.2. Состав питательных сред и условия культивирования штаммов, использованных в работе.
2.2. Методы .
2.2.1. УФоблучение суспензии клеток
2.2.2. Оценка чувствительности к метилметансульфонату
2.2.3. Определение чувствительности клеток к азотистой кислоте .
2.2.4. Определение чувствительности клеток к перекиси водорода
2.2.5. Обработка 8метоксипсораленом 8МОП и длинноволновым УФизлученисм дУФ, Х5 нм.
2.2.6. Анализ процесса межплазмидной рекомбинации
2.2.7. Анализ митотической межхромосомной рекомбинации
2.2.8. Учет частоты спонтанных мутаций канаванинустойчивости .
2.2.9. Оценка уровня индуцированного УФлучами мутагенеза.
2.2 Определение группы сцепления мутаций методом дестабилизации хромосом
2.2 Микроманипулирование и тетрадный анализ
2.2 Трансформация БассИ. сегечтае.
2.2 Выделение ДНК из дрожжей при переносе
челночных плазмид в Е.соИ.
2.2 Трансформация Е.соИ
2.2 Выделение небольших количеств двуцепочечной плазмидной ДНК из Е.соИ кипячением
2.2 Выделение больших количеств двуцепочечной илазмидной ДНК из Е.соИ методом щелочного лизиса
2.2 Осаждение ДНК этанолом.
2.2 Аналитический электрофорез с выделением ДНК в лунках
2.2 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей.
2.2 ПЦР .
2.2 Секвенирование ДНК .
2.2 Стандартные молекулярнобиологические
и микробиологические методы.
2.2 Статистические методы обработки результатов
ГЛАВА 3. РНЗУЛЬТАТЫ
3.1. Отбор мутантов с нарушенной репарационной способностью
V
3.2. Картирование гена .
3.3. Свойства мутации .
3.3.1. Чувствительность мутанта к действию различ
ных мутагенов.
3.3.2. Влияние мутации на мутагенез
, 3.3.3. Влияние мутации на рекомбинацию
3.3.4. Анализ влияния мутации на формирование и выживаемость аскоспор
3.3.5. Чувствительность мутанта к летальному действию 8МОПдУФ
3.3.6. . Взаимодействие мутации с мутациями в ге
нах различных систем репарации ДНК
3.3.6.1. Взаимодействие мутаций га и 2
3.3.6.2. Взаимодействие мутаций и
3.3.6.3. Взаимодействие мутаций и
3.3.6.4. Взаимодействие мутаций и i
3.4. Клонирование гена . Доказательство идентичности гена
гену I1, описанному ранее.
3.5. Создание нулевой аллели гена I
3.6. Свойства нульаллели гена .
3.7. Секвенирование нуклеотидной последовательности мутантной
аллели .,
3.8. Создание делеции Сконцевого домена
3.9. Сравнение свойств штамма с мутацией и штамма с де
лецией Сконцевого домена .
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Идентификация мутации , приводящей к нарушению
процесса .
4.2. Данные из литературы о роли продукта гена ЯАй 1ЮН
ТЮ1 в диплоидспецифической рекомбинации.
4.3. Роль продукта гена ЯА9ЯНТЮ1 в процессе эксцизион
ной репарации оснований.,
ВЫВОДЫ .
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Определение уровня спонтанного и индуцированного мутагенеза у штамма, несущего мутацию . Анализ влияния этой мутации на межплазмидную и межхромосомную рекомбинации. Установление характера взаимодействия мутации и мутаций в генах ряда известных систем репарации ДНК путем сравнения чувствительности к летальнрму и мутагенному действию УФлучей или ММС двойных и одиночных мутантов. Изучение такого взаимодействия было направлено на определение процесса, в котором участвует продукт гена . Клонирование гена , локализация мутации в пределах гена и определение роли соответствующего продукт в процессе репарации ДНК. Работа выполнена в лаборатории генетики эукариот Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б. П. Константинова Росбийской Академии Наук. ГЛАВА 1. СИСТЕМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У ДРОЖЖЕЙ vii Обзор литературы. Геномная ДНК представляет бобой крупную биомолекулу, которая должна сохраняться в течение всего срока существования клетки. Вместе с тем, молекула ДНК обладает ограниченной стабильностью, и в ней постоянно возникают повреждения различного рода, вызванные как процессами нормального метаболизма клетки, так и различными воздействиями внешней среды. Возникновение таких нарушений структуры ДНК может быть причиной гибели клетки иили появления мутаций. Образование аиурина. Пиримидиновые димеры являются основным повреждением, возникающим иод действием облучения ультрафиолетовыми лучами УФ двуцепочечные разрывы ДЦР возникают под действием ионизирующего излучения. Сшивки двух нитей ДНК возникают под действием бифункциональных алкилирующих агентов например, псоралена. Потери оснований ДНК происходят в клетке спонтанно, так как гликозильная связь между основанием и дезоксирибозой обладает заметной лабильностью. При этом образуются Iсайты. К возникновению АПсайтов приводит также действие специфических ферментов, ДНК гликозилаз см. АПсайты имеют как мутагенный, так и цитотоксический эффект , , . Модификации оснований происходят как спонтанно, так и под воздействием разнообразных химических агентов. ДНК заменяется кетогруппой. Наиболее важным процессом дезаминирования является потеря цитозином аминогруппы с образованием урацила. Другие реакции дезаминирования включают превращение аденина в гипоксантин, гуанина в ксантин, 5метилцитозина в тимин. Хорошо изученным дезаминирующим агентом является азотистая кислота. Окисление оснований происходит под действием различных перекисных соединений и свободных радикалов, которые возникают в ходе клеточного метаболизма и под действием ионизирующей радиации. К алкилированию оснований приводит воздействие как экзогенных химических веществ например, ММС, так и эндогенного аденозилметионина, биологического донора метильных групп. Большинство модифицированных оснований имеют слабый цитбтоксический и высокий мутагенный эффекты, но некоторые из них например, 3метиладенин блокируют репликацию и транскрипцию ДНК и обладают преимущественно цитотоксическими свойствами v . Ошибочно спаренные основания и микропетли ДНК, как правило, возникают в процессе репликации. Такие повреждения являются предмутационными ЗЬаарег, . Большое разнообразие повреждений первичной структуры ДНК рождает проблему поддержания стабильности генома клетки, поэтому не удивительно, что в ходе эволюции живые организмы приобрели разветвленную сеть репарационных процессов, устраняющих эти повреждения. Они включают коррекцию репликативных ошибок, репарацию повреждений ДНК, регуляцию межвидовой рекомбинации, мейотическую и митотическую рекомбинацию. Репарацию принято разделять на три основных класса прямая, эксцизионная, которая включает в себя три самостоятельные вегви эксцизионная репарация оснований, нуклеотидная эксцизионная репарация, коррекция ошибочно спаренных оснований и рекомбинационная Табл. К этим классам часто добавляют пострепликативную репарацию, которая в строгом смысле слова не является репарацией, а, скорее, относится к системам, обеспечивающим толерантность клетки к повреждениям ДНК.