Картирование генома человека с помощью флюоресцентной in situ гибридизации : Субхромосомная локализация 137 последовательностей

• Автор: Воробьева, Надежда Валентиновна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 103 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений стр.

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Структура и функции метафазных бэндов.

1.1.1. Виды хромосомного бэндинга.

1.1.2. Уровни разрешения хромосомного бэндинга

1.1.3. Мозаичная структура генома, изохоры, композиционное картирование.

1.1.4. Распределение повторов

1.1.5. Распределение генов, островки.

1.1.6. Организация хроматина в интерфазе и метафазе

1.1.7. Транскрипция
1.1.8. Репликация
1.1.9. Рекомбинация
1.1 Эволюционные аспекты композиционной
мозаичности
1.1 Заключение.
1.2. ii и i клоны как инструмент картирования генома.
1.2.1. Основные принципы физического картирования
1.2.2. Сайты редкощепящих рестриктаз как генные
маркеры в геноме человека
1.2.3. Конструирование ii и i библиотек.
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы.
2.2. Методы
2.2.1. Выделение ДНК плазмид и определение размера
вставок
2.2.2. Гибридизация ДНК ii клонов с биотинилированными ДНК человека и мыши
2.2.3. Получение 1 ДНК
2.2.4. Синтез биотинилированных зондов для I
2.2.5. Получение препаратов метафазных хромосом
2.2.6. Флюоресцентная i i гибридизация.
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Картирование 2 сайтов хромосомы 3 человека.
3.1.1. Стратегия картирования и основные этапы работы
3.1.2. Выделение и анализ ii клонов
3.1.3. Картирование ii клонов с помощью I.
3.1.4. Гомология ii клонов с генами и экспрессирующимися последовательностями.
3.1.5. Распределение сайтов и генов по хромосоме 3 человека.
3.1.6. Использование ii клонов в сравнительном картировании.
3.2. Локализация отдельных генов на хромосомах человека
3.2.1. Локализация кератиноподобного гена крысы
на хромосоме 9 человека
3.2.2. Локализация пробы рН2 локуса
3.2.3. Исследование возможности применения в i i гибридизации химически биотинилированных зондов
3.2.4. Локализация генов рибосомных белков и
3.3. Заключение
Выводы.
Приложение 1.
Приложение 2.
Список литературы


В процессе работы выделено 6 уникальных ii клонов, из которых 2 клона тонко локализованы на хромосоме 3 человека. Превращение ii клонов в путем секзенирования фланкирующих районов и их локализация на цитогенетической карте хромосом с помощью флюоресцентной i i гибридизации позволяет упорядочить сайты, расположенные на значительном расстоянии друг от друга, т. карту. Полученная карта является в настоящее время наиболее полной из известных карт третьей хромосомы человека. Исследовано распределение сайтов и генов. Показано, что большинство локализованных уникальных ii клонов гомологичны генам или анонимным экспрессирующимся последовательностям, значительная часть которых до сих пор не была картирована. Это позволит использовать в дальнейшем полученные в качестве генных маркеров при интеграции генетической и физической карт третьей хромосомы, а также для поиска новых генов. Проведенные эксперименты по использованию ii клонов для локализации гомеологичных районов хромосомы 3 человека и хромосомы свиньи показали перспективность их применения в качестве зондов 8 работах по сравнительному картированию геномов млекопитающих. Представленные данные по локализации ii клонов были использованы сотрудниками Каролинского института для поиска i клонов и построения контиг района 3р. . Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на конференциях по программе Геном человека гг. Института цитологии и генетики г. Вклад автора. Из 0 исследованных кпоноз автором выделено и проанализировано около 0. Частичное секвенирование выделенной ллазмидной ДНК, отбор уникальных клонов и компьютерный поиск гомологии с известными генами и кДНК клонами выполнены сотрудниками Каролинского институтита, а также в Институте молекулярной биологии Москва и в НПО Вектор Новосибирск. Выделение ДНК уникальных клонов, синтез меченых зондов и флюоресцентная i i гибридизация сделаны автором. окрашивание и идентификация хромосомных районов человека и свиньи выполнены . . Графодатским и А. И. Протопоповым. Публикации. По теме диссертации опубликовано статей. Структура и объем работы. Диссертация содержит разделы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы 3 ссылки. Один из традиционных методов картирования известных генов и анонимных последовательностей это локализация их на препаратах метафазных хромосом с помощью флюоресцентной i i гибридизации I. Несмотря на разработку новых подходов использование маркеров и гибридных панелей высокого разрешения, I является наиболее простым и эффективным инструментом картирования. К настоящему времени тысячи генов локализованы на хромосомах этим методом и он остается незаменимым при сравнительном картировании геномов. Успехи последних лет в исследовании структуры и функции метафазных бэндов человеческих хромосом, изложенные в данном разделе, привели к тому, что локализация любой последовательности относительно метафазного бэндинга высокого разрешения потенциально обеспечивает информацию об ее составе, ближайшем окружении, типе экспрессии, времени вступления в репликацию и ряд других структурнофункциональных характеристик. Цитогенетическое картирование базируется на хорошо разработанных техниках дифференциального окрашивания то есть получения характерной для каждой хромосомы картины поперечной исчерченности бэндинга. Хромосомный бэндинг дает возможность не только идентифицировать хромосомы, но и локализовать картируемый материал относительно определенных, стабильно воспроизводимых хромосомных бэндов. Исследования структуры и функциональной активности хромосомных бэндов на молекулярном уровне показали, что хромосомы млекопитающих гетерогенны по длине и состоят из чередующихся блоков хроматина, отличающихся друг от друга нуклеотидным составом, степенью конденсации, насыщенностью генами и различными повторами, временем вступления в репликацию и рядом других характеристик.