Характеристика спектра молекулярной патологии при ретинобластоме и разработка ДНК-диагностического протокола

• Автор: Бабенко, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клиникогенетическая характеристика заболевания

1.1.1. Клиническая характеристика ретинобластомы

1Л .2. Генетическая характеристика РБ

1Л .3. Цитогенетическая характеристика РБ

1.2. Картирование, клонирование и характеристика гена I

1.3. Белковый продукт гена 1.

1.3 Л. Строение 1

1.3.2. Роль 1 в регуляции клеточного цикла.
1.3.3. Семейство подобных белков
1.3.4. Участие 1 в патогенезе других опухолей
1.3.5. Взаимодействие генов, регулирующих клеточный цикл.
1.4. Молекулярные механизмы канцерогенеза
1.4.1. 2х ударная модель канцерогенеза
1.4.2. Потеря гетерозиготности.
1.4.3. Мутационный процесс.
1.4.3 Л Структурные мутации гена i и методы их детекции.
1.4.3.2. Феногенотипические корреляции.
1.4.4. Метилирование ДНК как пример эпигенетической регуляции геновсу ирессоров опухолевого роста.
1.4.4.1. Молекулярные механизмы метилирования.
1.4.4.2. Метилирование и канцерогенез.
1.4.4.3. Методы исследования статуса метилирования ДНК
1.4.4.4. Метилирование деацетилирование структура хроматина
1.5. Разработка ДНКдиагностического протокола.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клинический материал
2.2. Забор крови и операционного материала.
2.3. Выделение геномной ДНК
2.4. Полимеразная цепная реакция.
2.5. Рестриктный анализ. ,,.
2.6. Детекция точковых мутаций методом
2.7. Анализ гстеродуплексов
2.8. Микросателлитный анализ.
2.9. Метод метилчувствительной ПЦР.
2 Определение нуклеотидной последовательности
2 Программное обеспечение
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.
3.1. Спектр мутаций при различных формах ретинобластомы
3.1.1. Анализ точковых мутаций в гене 1
3.1.1.1. Мутации кодирующей области гена
3.1.1.2. Мутации сайтов сплайсинга
3.1.2. Структурные перестройки гена I.
3.1.3. Определение характера мутаций герминального или соматического
3.1.4. Полиморфизмы, обнаруженные в гене I
3.2. Анализ состояния зиготности в РБ
3.3. Исследование статуса метилирования промоторных районов генов
и 2.
3.4. Разработка ДНКдиагностического протокола для исследования
различных форм ретинобластомы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


До недавнего времени для своевременной диагностики РБ был единственный путь регулярное офтальмологическое обследование в первые годы жизни детей, в семьях которых встречаюсь случаи ретииобластомы. Ранняя диагностика дает возможность проведения эффективного лечения локальная лазерная терапия, фото и криокоагуляция. На более поздних этапах развития РБ необходимо хирургическое вмешательство энуклеация и сопутствующие курсы радио и химиотерапии. В связи с этим возникает необходимость разработки новых эффективных молекулярных методов диагностики РБ, оценки повторного риска возникновения опухоли в семье с ретинобластомой. Молекулярная диагностика мутаций при ретинобластоме в настоящее время в отечественной лабораторной практике практически не используется, хотя широко применяется за рубежом в крупных медицинских центрах. Цель и задачи исследования. Основной целью работы является молекулярногенетическое исследование причин возникновения ретинобластомы и разработка эффективного ДНКдиагностического протокола для различных форм ретинобластомы на основе молекулярнобиологических технологий. Поиск и характеристика точковых мутаций и микроструктурных аномалий гена I у пациентов с рстинобластомой. Исключение герминального характера мутаций и их носительства у родственников больного с ретинобластомой. Проведение анализа состояния зиготности гена 1 в операционном материале ретинобластомы с использованием внутригенных и внегенных микросателлитных маркеров. Проведение анализа промоторной области гена в целях поиска аномального метилирования, как одной из возможных причин возникновения ретинобластомы. Проведение анализа состояния метилирования промоторной области гена 62 в образцах ретинобластомы. Разработка ДНКдиагностического протокола. Оптимизация диагностических подходов с целью раннего выявления опухоли и оценки риска заболевания у близких родственников больного с ретинобластомой. Научная новизна. В результате проведенного исследования изучен спектр молекулярной патологии структурные и функциональные нарушения в гене 1 у пациентов с различными формами ретинобластомы в семьях. Выявлено мутаций в различных экзонах и интронных областях гена I. В случаях подтвержден герминачьный характер мутаций. Описаны 3 новых полиморфизма в гене 1. Обнаружено аномальное метилирование промоторной области гена 1 в образцов ретинобластомы, что значительно превышает данные зарубежных авторов. Впервые проведено исследование статуса метилирования промоторной области гена 62 в образцах ретинобластомы, продемонстрировано 9 случаев аномального мегилирования из исследованных опухолей. Разработана мультиплексная мстил чувствительная ПЦР для совместной оценки статуса метилирования промоторных районов генов 1 и 62. Показано, что работу но скринингу мутаций у больных со спорадической формой РБ целесообразно проводить на ДНК из операционного материала. Исследование структурных изменений в случае семейной иили двухсторонней ретинобластомы возможно проводить на ДНК из лимфоцитов периферической крови пациентов с РБ и их близких родственников. Практическая значимость. В результате выполненного исследования разработаны подходы для молекулярной диагностики и характеристики микроструктурной патологии, мугаций и функциональных нарушений в гене 1, приводящих к развитию ретинобластомы. Результаты исследования внедрены в практику работы РОНЦ РАМН, МИГБ им. Гельмгольца, межрегиональных МГЦ и региональных медикогенетических консультаций. Социальноэкономическая значимость результатов связана с повышением точности лабораторной диагностики, возможностью проведения пренатальной диагностики, прогнозом течения и профилактикой заболеваний. Положения, выносимые на защиту. Определены частота и спектр молекулярной патологии гена 1 при различных формах регинобластомы. Охарактеризованы новые мутации и полиморфизмы в гене 1. Показано, что аномальное метилирование промоторных участков генов 1 иили 62 является одним из механизмов, приводящих к развитию опухоли. Разработаны оптимальные подходы для лабораторной ДНКдиагностики наследственной и спорадической форм ретинобластомы.