Получение и анализ трансгенных растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh с повышенной экспрессией генов

• Автор: Погорелко, Геннадий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

Отбор и анализ новых морфологических мутантов АЛкаНапа с повышенной экспрессией близ лежащих к инсерции ТДНК генов. Научная новизна. Создана и проверена принципиально новая система векторов рЕпЬохрСге ОепЬапк Ш РО. Р П для трансформации двудольных растений. Получена и охарактеризована коллекция супсрэкспрессирующих инсерциониых мутантов А. ШаИапа, на данный момент состоящая из 6 линий, несущих ТД1ПС с сильным 8 промотором. Разработан модифицированный метод определения локализации инсерций ГДНК в геноме трансгенного объекта. Впервые идентифицированы и функционально охарактеризованы гены Аи0 и А0 А. МаИана, конститутивная экспрессия которых влияет на нормальный морфогенез А. ЖаИапа. Впервые экспериментально получена полноразмерная кДИК гена Аг и определена ее нуклеотидная последовательность, продукт которого относится к классу РЕАНЬох АТФзависимых хеликаз АлИаИапа. Практическая значимость работы. Созданная система векторов рЕпЬохрСге может быть использована для получения и легкого анализа коллекций трансгенных двудольных растений. Разработанный модифицированный метод определения локализации инсерций ТДНК в геноме, отличающийся высокой эффективностью, может быть использован для широкого спектра трансгенных объектов. Функционально охарактеризованные гены А0, Аг1 0 и 5б0 А. МаИапа представляют интерес для исследования как генетического контроля морфогенеза АлкаИапа, так и дополняют исследования в области функциональной организации геномов как модельного растения А. ОгаИапа, так и других высших растений. Состояние проблемы. Современный уровень развития молекулярной генетики открывает новые области в исследованиях структурнофункциональной организации геномов различных организмов. Развитие методов клонирования и секвснирования позволило ввести в круг объектов самые разнообразные виды микроорганизмов, грибов, высших растений и животных, включая человека. Разработаны методы генетической трансформации высших растений. А. i широко используется в качестве модельного объекта ввиду особенностей организации его генома, а также изученности физиологических и морфологических характеристик развития , i, . На схеме 1 изображены основные направления и методы изучения структурнофункциональной организации генома. Схема Методы изучения структурнофукционалыюй организации генома. Такие исследования структурной организации геномов, как секвснированис ДНК, РНК, белков, клонирование генов, использование технологии i микрочипов, определение открытых рамок считывания и функциональных доменов позволили создать компьютерные базы данных, дающие возможность предполагать функции новых генов, их структуры и продуктов при помощи анализа идентичности состава их первичной структуры ДНК иили белковых продуктов с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями генов и белков организмов, относящимся к тем же, либо к другим таксономическим подразделениям v . ПЦР в реальном времени позволяющий, оценить уровень экспрессии исследуемого гена i . Для сравнения белкового состава клеток или целых организмов используется метод двунаправленного ИААГэлектрофореза, позволяющий проводить мониторинг экспрессии и посттрансляционной модификации сотен белков параллельно , , . Для исследования свойств продуктов генов высших организмов широко используется метод функциональной экспрессии чужеродных белков и пептидов в дрожжах Согеу . Несмотря на широкие возможности изучения функций генов на различных уровнях биохимическом, клеточном и на различных этапах развития организмов, вопрос о конкретной взаимосвязи гена с его функцией часто остается открытым . Следовательно, на современном этапе развития функциональной геномики основной становится задача определения функциональной значимости нуклеотидных последовательностей ДНК . Определение взаимосвязи между последовательноеими ДНК и их функциями. Для установления связи между структурой и функцией гена нужно изменить экспрессию этого гена. Это достигается несколькими методами, например замена исходного гена на мутантный при помощи гомологичной рекомбинации , , i .