Цитогенетический и электронно-микроскопический анализ районов локализации транспозонов в политенных хромосомах Drosophila melanogaster

• Автор: Шлома, Виктор Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 133 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Цель данной работы.

Научная новизна

Практическая ценность.

Апробация работы

Вклад автора.

Объем работы.

Публикации.

Благодарности

Список использованных сокращений.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Структура политенных хромосом
Открытие политенных хромосом.
Хромомерный рисунок политенных хромосом, построение
цитологических карт и правила картирования.
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА И ИНФОРМАЦИОННОЕ
СОДЕРЖАНИЕ ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОМОМ.
Размеры дисков.
Организация дисков.
Район АР 2Ь хромосомы.
Район 9ЕВ.
Характеристика пуфов.
Транскрипционная активность пуфов
Морфология пуфов.
МЕЖДИСКИ
Структура междисковых районов
Генетическое содержание междисков
Транскрипционная активность междисков
МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРУКТУР ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ
Метод опосредованной трансформации.
ЭМ анализ трансформированных фрагментов ДНК в составе
политенных хромосом
Диски, возникающие при трансформации.
Пуфы, возникающие при активации транспозированных фрагментов
Образование междисков из материала трансформированных
конструкций
Изучение междисков при помощи трансформированных в геном
конструкций
Заключение и постановка задачи.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Генет ические линии дрозофилы, их ведение
Характеристики использованных в работе транснозонов
Получение трансформированных линий.
Определение группы сцепления инсерций гранспозонов.
Выяснение летальной стадии мутации 126, вызваной инссрцией
транспозона в район 2 хромосомы.
Приготовление препаратов для световой микроскопии и .гибридизации
i ii
Приготовление препаратов для электронной микроскопии.
Правила ЭМ картирования политенных хромосом и анализ ЭМ фотографий
Окраска тканей и органов личинок 3го возраста и мух на Р
галактозидазу
Мечение ДНК
Гибридизация ДНКДНК i i на политенных хромосомах
Гибридизация с использованием зонда, меченного 7.
Флуоресцентная ДИКДНК i i гибридизация на политенных
хромосомах I
Гибридизация i i для электронномикроскопического анализа
Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях
Выделение плазмидной ДНК.
Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
Получение коллекции трансформированных линий.
Элскгронномикроскопичсская гибридизация i i.
Элекгронномикроскопический анализ районов инссрций транспозонов
, 4 и .
Линия 0 .
Линия 1 .
Линия 9 .
Линия 4 .
Линия 8.3
ЭМ анализ линий, нежизнеспособных в гомозиготе по инсерции
Линия 126
Линия 8.2
Электронномикроскопический анализ районов инссрций транспозона
.
Линия ,1
Линия ,4
Линия ,3
Линия ,1
Электронномикроскопический анализ района инсерции транспозона , ..
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
Коллекция трансформантных линий.
Гибридизация i i на ЭМ уровне метод тонкого картирования
нуклеотидных последовательностей
ЭМ анализ структур, формируемых на основе материала
транспозонов
Анализ районов инсерции транспозонов , Р1АгВ и .
Анализ встроек транспозона .
ЭМ картирование встроек, приводящих к летальному фенотипу.
Морфология дисков, возникающих на основе материала инссрций
Информационное содержание междисков в районах инсерций
Моделирование темных пуфов политенных хромосом
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


При помощи подходящих конструкций осуществить моделирование темных пуфов. В настоящей работе впервые осуществлено ЭМ картирование встроек транспозонов, вызывающих появление летального фенотипа у особей, гомозиготных по инсерции. Также при помощи встроек транспозонов различного размера проведено моделирование дисков различной толщины. Впервые экспериментально показано, что размер среднего диска в политенных хрососомах составляет т. На основе данных ЭМ анализа встройки транспозона проклонирована и проанализирована ДНК междиска АЗ5, который, как было показано в результате анализа, содержит промоториую область гена Ix. При помощи конструкции , содержащей фрагмент ДНК междиска С7С8 показано, что данного фрагмента недостаточно для формирования нового междиска в районе вспройки транспозона . Впервые проведен ЭМ анализ структур, формируемых на основе материала конструкции, содержащей промоторную область гена домашнего хозяйства и находящейся под ее контролем последовательности гена . Показано, что в районе инсерции такой конструкции формируется новый рыхлый диск, по характеристикам сходный с малыми пуфами. Также в результате ЭМ анализа структур, формируемых на основе последовательно встроенных в один район повторенных копий транспозона РгуРгаи впервые проведено моделирование так называемых темных пуфов. ДНК и формируемыми на их основе структурами политенных хромосом. В стендовом сообщении на XII Всероссийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра, октября г. Санкг Петербург, Россия. В стендовом сообщении на УН Европейском конгрессе по энтомологии. Сезке Вкоус, Чехия. В стендовом сообщении на Всероссийском симпозиуме по структу ре и функциям клеточного ядра, октября г. Санкт Петербург, Россия. Основные результаты получены автором самостоятельно. Работы по ЭМ картированию инсерций проводились как совместно с В. Ф.Семешиным, гак и самостоятельно. Автор принимал непосредственное участие в разработке описанного в данной работе метода ЭМ i i гибридизации. Молекулярный анализ ДНК междиска АЗ5 выполнен С. А.Демаковым и И. В.Макуниным. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 1 ссылка. Работа изложена на 3 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и рисунков. Семешин В. Ф., Артеро Р. ПересАлонсо М. Шлома В. Электронномикроскопическая гибридизация i i проб, меченных дигоксигенином, с политенными хромосомами i Цитология. Т. . . Стр. i V. ., , . . . V. Г.В. Похолкова, В. В. Шлома, В. Ф. Семешин, Е. С. Беляева, И. i Цитология. Т Стр. v, . V., Т. . v, V. V. , I. . iv i i i iii xii . I. v. V. . . . i, V. ., I. . iv, . . v, V. V. , . V. v. i ii i . I. v. V. . . . i V. ., . М. V. i i i iii i i V . vi. . .8. Автор глубоко благодарен В. Ф. Семешину, под руководством и при содействии которого была выполнена данная работа, И. Ф. Жимулеву, Е. С. Беляевой и всем сотрудникам лаборатории молекулярной цитогенетики за помощь и поддержку в работе. Особую благодарность хотелось бы выразить Ю. Б. Шварцу, I. . Омельянчуку, Д. В. Кларк, С. А. Шестопал и И. В. Макунину за любезно предоставленные линии мух, С. А. Демакову, А. А. Алексеенко, Ю. Б. Шварцу, И. В. Макунину, Д. Е. Корякову, Е. Н. Андреевой, Т. А. Гайнер, . . Шлома и Л. В. Болдыревой за консультации, помощь в работе и дружескую поддержку. ЭМ электронная микроскопия, электронномикроскопический .