Исследование невирусных способов доставки генных конструкций для генотерапии миодистрофии Дюшенна

• Автор: Баранов, Александр Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 111 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫГ

2.1. Локализация и клонирование Гена дисгрофина II

2.2. Мутации в гене дистрофика.

2.3. Белковый продукт гена дисгрофина

2.3.1. Локализация, структура и фикция мышечного дисгрофина

2.3.2. Изоформы дисгрофина.

2.4. Аугосомный гомолог дисгрофина утрофнн

2.5. Молекулярные основы патогенеза МДДБ

3 2.5.1. Мембранная теория и патогенеза МДДБ.
2.5.2 Дистрофии опосредованный каскад процессов дегенерации мышц
2.5.2.1. Нарушения в сборке дистрофии ассоциированного глюкопротеинового
комплекса
Аномалии ионного балансаг.
Нарушения мембранно ассоциированных сигнальных процессов.
Особенности патофизиологических процессов при МДД
Двухфазная модель патогенеза МДДЪ
Исследования поенотерапнн мышечной дистрофии Дюшснна
Генотсрапия новое направление медицины.
Способы доставки генных конструкций в клетки эукариот
Основные направления исследований по генотераиии МДДБ.
Вирусные способы доставки кД 1К гена дисгрофина
евирусныс способы доставки кДНК гена дисгрофина
Заместительная генокоррекция МДДБ.
Активизация экспрессии гена угрофина.
Клинические испытания по генотератш МДД
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материал.
Экспериментальные животные.
Клеточные линии
1. 2.З.2.2.
2.5.2.3.
1 2.5.2.4.
в .2.5.
2.6.1.
1 Ц щ 2.6.2. 2.6.3.
Ь 2.6.3.1.
и 2.6.3.2.
Т 2.6.3.3.
П9 2.6.3.4.
2.6.4. 3.
Яр 3.1.
У 3.1.1.
3.1.2.

3.1.3. Генетические конструкции.
3.1.3.1. Конструкции с маркерным геном Ьас
3.1.3.2. Конструкции с к ДНК гена дистрофию человека
3.1.4. Носители и способы трансфекции.
3.1.4.1. Генное ружье
3.1.4.2. Аналоги вирусных одигопептндов.
3.1.4.3. Липофектамнн.
3.1.4.4. Синтетические полимерные микросферы МР2.
3.1.5. Олитнуклеотидные праймеры
3.1.6. Реактивы.
3.1.7. Оборудование.
3 2. Методы.
3 2.1. Выделение плазмидной ДНК.
3.2.2. Сборка комплексов ппазмилная ДНК носитель
3.2.2.1. Баллистическая трансфекция.
3.2.2.2. Комплексы с аналогами вирусных олигопептидов
3.2.2.3. Катионные липосомы.

i i И
V
а
X
3.2.2.4 Синтетические полимерные микросферы
3.2.2. Проведение трансфекции т чтуо
3.2.3.1. Внутримышечные инъекции комплексов ДНКнрептель
3.2.3.2. Баллистическая трансфекция
3.2.4. Забор материала для анализа результатов трансфекции
3.2 5. Выявление экспрессии гена дистрофика иммуногнстохнмическим методом
3.2.8. Проведение и анализ результатов ЦР реакции
3.2.9. Выделение тотальной РНК из тканей мышей и проведение обратно
транскрипционной полимеразной цепной реакции ОТНЦР с
3.2 Анализ межткансвого распределения и внугриклетой локализации
комплексов ДНКноситель методом гибридизации i i
3 Приготовление меченой ДНК пробы
3.2.6. Идентификация экспрессии маркерного гена . на тотальных препаратах
органов мышей.
3.2.7. Экстракция ДНК из тканей мышей x
4
. 3 1кизо0шый вариант гибридизации i i на гистологических препаратах.

i
V
3.2.1. Исследование внутриклеточной локализации комплексов МР2плачмндная
а
3 Анализ препаратов
ДНК п vi.
2 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Диализ результатов трансфекции мышц мышей ix кДНК гена дистрофика человека метолом баллистической трансфекции
4.1.1. Баллистическая фансфекция полноразмерной кДНК гена дистрофина
4.1.2. Баллистическая фансфецня кДНК минигена дистрофина.
4.2. Анализ экспрессии кДНК гена дистрофина человека в мышцах мышей
x после фаисфекцни с помощью лнпосом и синтетических олигопептидов
4.2.1. Трансфекция комплексами ДНКСОК с различными суммарными зарядами.
4.2.2. Анализ динамики н лозовой зависимости при трансфекции с СОК.
4.2.3. Анализ мешканевого распределения комплексов плазм иди ая ДНКСОК
4.2.4. Трансфекция с использованием поликагнонных липосом.
4.3. Изучение особенностей трансфекции и экспрессии кДНК гена дистрофина
человекам маркерного гена , доставленных в мышцы мышей x с помощью синтетических микросфер 2
4.3.1. Экспрессия дистрофина в мышцах мышей x после трансфскщ
полноразмерной кДНК гена дистрофина в составе микросфср 2.
4.3.2. Экспрессия дистрофина в мышцах мышей x после трансфекции к ДНК
чт I
мини гена дистрофина в составе микросфер 2.
4.3.3. Экспрессия маркерного гена 7 доставленного с помощью
синтетических микросфер 2
4.V4. Анализ особенное юй межтканевого распределения и внутриклеточной
локализации ДНК полимерных комплексов 2 в экспериментах i viv и i vi
4.3 4.1. I анализ образцов органов мышей xx после введения ДНК полимерных
комплексов 2
4.3.4.2. Анализ внутриклеточной локализации полимерных микросфер 2 в
экспериментах i vi. .
5. ВЫВОДЫ.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Л ВС О диам и нобн циклооктан АТФ адснозинтрифосфат ГТ 1 енная терапия
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДПМВ дистрофии положительные мышечные волокна
кДНК комплементарная ДНК
ЛФА лшюфектамин дрГесАМШЕФ
МВмышечные волокна
МДД Б мышечная дистрофия ДюшениаУ Беккера мРПК матричная РНК
ОТПЦР обрашотранскрнпиионная полимеразная цепная реакция п о. пар основании ААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
РНК рибонуклеиновая кислота
СОК синтетические олигопептидньк комплексы
ТВЕ трнсборатный буфер
ТЕМЕД . гетрамстидэтиленднамин
ФИТЦ ПТС флуорссцсиниэотвоцианат
цАМФ циклический аденозинмонофосфат
ЭДТ А этилендиаминтетраацетат
ЭР эндоплазматичеекий ретикулум
ВВЕДЕНИЕ


Основным продуктом гена в мышечных тканях является присарколеммный белок мышечный дистрофии, выполняющий функцию связующего звена между внутренним щггоскелетом миофибриллы и внеклеточным матриксом. Присутствие в мембране мышечного волокна аномального белка МДБ или же его полное отсутствие МДД, индуцирует первичные нарушения в структурной организации и функции сарколеммы, что приводит к запуску каскадного процесса дегенерации мыши I . Огсутствис эффективного медикаментозного лечения делает актуальной разработку новых генотерапевтическнх подходов к лечению миодисгрофии ДюшсннаБеккера. Суть метола, заключается во введении больному конструкций с нормальным геном днетрофина, обеспечивающим синтез полноценною белка и восстанавливающим структуру и функцию мыши. В экспериментах i viv на биологических моделях МДД мышах x. ДНК гена дисгрофина человека. К сожалению, кардинальных успехов в генотсрапии МДДБ пока не достигнуто Баранов. Причиной этого являются, не только гигантские размеры гена и его мРНК, но и, главным образом, отсутствие эффективных средств доставки гена в мышцы. Системы доставки генных конструкций, или носители, должны обеспечивать компактнзацню ДНК. ДНК лиэосомалышми ферментами и обеспечивать ядерную транслокацию. Считается, что достижение терапевтического эффекта возможно при успешной трансфекции не мснсс , а, по последним данным, даже мышечных волокон не только скелетной, мускулатуры, но так же мышц сердца и диафрагмы . При этом Основными критериями эффективности трансфекции и терапевтического эффекта являются появление дистрофииположительных мышечных волокон ДПМВ, нормализация уровня биохимических маркеров МДДБ. ДПК гена дистрофика вводили с помощью аденовирусного или ретровирусного векторов i . Использование вирусных носителей, однако, наталкивается на существенные методические трудности. Наибольшим препятствием к использованию вирусных векторов является выраженный иммунный ответ на вирусные антигены Вышеперечисленных недостатков в
значительной мере лишены невирусные носители липосомы. Однако эффективность трансфекции при их использовании i viv оказывалась очень низкой . Таким образом, проблема создания и испытаний новых средств доставки генных конструкций в мышцы продолжает оставаться актуальной проблемой гемотерапии миодистрофии Дюшснна. Данная работа является продолжением цикла проводимых лабораторией пренатальной диагностики НАГ РАМН исследований, по разработке экспериментальных основ гемотерапии МДДБ и посвящена анализу результатов доставки кДНК гена дистрофина человека в мышцы мышей тпбх при помощи различных типов невирусных носителей генов. Цели и задачи исследования. В экспериментах показано су шествование феномена дистантной рансфекции . Показана возможность прохождения синтетических полимерных микросфер с терапевтическими генами через гсматоэнцсфалнчсский барьер. Полученные результаты могут быть использованы в качестве экспериментальной основой дли разработки доклинических и первой клинической фаз испытаний геннотерапевтических конструкций для лечения мнодистрофии Дюшенна. Апробация работы
Представленные в диссертации результаты были доложены на VIII итоговой конференции Геном человека Черноголовка. У8, ежегодном совещании Европейского общества по генетике человека Лисабон, , VI совещании Европейской рабочей группы по генной терапия человека Иерусалим. V Российском Национальном Конгрессе Человек и лекарство Москва. II Американском ежегодном совещании по тенной терапии Вашингтон. IX итоговой конференции Геном чсловска Черноголовка, , II съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров СПетербург, . Ежегодном совещании по генетике человека Канада. Всероссийском сьезде медицинских генетиков Курск, . По теме диссертации опубликовано работ. Работа изложена на 1 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 8 таблицами и рисунками. Диссертация состоит из следующих разделов Введение, Обзор литературы. Материалы и методы исследования. Результаты и обсуждение. Выводы. Список литературы насчитывает 5 наименований.