Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс

• Автор: Анохина, Екатерина Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.13, 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки МСК

1.1.1 Понятие стволовости, стволовой клетки, мезенхимальной 9 стволовой клетки

1.1.2 Морфология культивируемых МСК и их гетерогенность

1.1.3 Пролиферативная активность культивируемых МСК и их гетерогенность

1.1.4 Иммуннофенотип культивируемых МСК и их гетерогенность

1.1.5 Дифференцировочные потенции МСК i vi и i viv и их

гетерогенность

1.2 Механизмы реализации воздействия гипоксии на клетки

1.3 Эффекты гипоксии на клетки i vi

1.3.1 Гипоксия и клеточная пролиферация
1.3.2 Гипоксия и жизнеспособность клеток
1.3.3 Гипоксия и иммунофенотип клеток
1.3.4 Гипоксия и дифференцировка клеток
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Используемое оборудование, материалы и реактивы
2.2 Приготовление сред для культивирования МСК костного мозга крыс
2.2.1 Приготовление полной среды
2.2.2 Приготовление остеогенной среды
2.2.3 Приготовление адипогенной среды
2.2.4 Приготовление среды для криоконсервации клеток
2.3 Получение и культивирования МСК костного мозга крыс
2.3.1 Получение первичных культур МСК костного мозга крыс
2.3.2 Пассирование первичной культуры и последующих субкультур
МСК костного мозга крыс
2.3.3 Культивирование клеток в условиях пониженного содержания
кислорода
2.3.4 Криоконсервация культивируемых МСК костного мозга крыс
2.4 Индукция дифференцировки МСК костного мозга крыс i vi
2.4.1 Индукция остеогенной дифференировки
2.4.2 Индукция адипогенной дифференцировки
2.5 Оценка характеристик культивируемых МСК костного мозга крыс
2.5.1 Принцип метода проточной цитофлуориметрии для анализа
антигенов и морфологических характеристик клеток
2.5.2 Оценка морфологических характеристик культивируемых МСК
костного мозга крыс
2.5.3 Оценка пролиферативной активности культивируемых МСК
костного мозга крыс
2.5.4 Оценка жизнеспособности культивируемых МСК костного
мозга крыс
2.5.5 Оценка иммунофенотипа культивируемых МСК костного мозга
2.5.6 Оценка дифференцировочного потенцала культивируемых МСК костного мозга крыс
2.5.6.1 Оценка остеогенной дифференцировки МСК
2.5.6.2 Оценка адипогенной дифференцировки МСК
2.6 Определение транскрипционного фактора I 1а в
культивируемых МСК костного мозга крыс
2.7 Оценка теломеразной активности в культивируемых МСК
костного мозга крыс
2.8 Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Характеристика культивируемых МСК костного мозга крыс
3.1.1 Первичные культуры МСК костного мозга крыс
3.1.2 Морфология культивируемых МСК костного мозга крыс
3.1.3 Пролиферативная активность культивируемых МСК костного
мозга крыс
3.1.4 Иммунофенотип культивируемых МСК костного мозга крыс
3.1.5 Дифференцировочный потенциал МСК костного мозга крыс i
3.2 Влияние гипоксии на культивируемые МСК костного мозга крыс
3.2.1 Влияние гипоксии на морфологию культивируемых МСК костного мозга крыс
3.2.2 Влияние гипоксии на пролиферативную активность культивируемых МСК костного мозга крыс
3.2.3 Влияние гипоксии на жизнеспособность культивируемых МСК костного мозга крыс
3.2.4 Влияние гипоксии на иммунофенотип культивируемых МСК костного мозга крыс
3.2.5 Влияние гипоксии на дифференцировочный потенциал культивируемых МСК костного мозга крыс
3.3 Влияние аноксии на культивируемые МСК костного мозга крыс
3.3.1 Влияние аноксии на морфологию культивируемых МСК костного мозга крыс
3.3.2 Влияние аноксии на пролиферативную активность культивируемых МСК костного мозга крыс
3.3.3 Влияние аноксии на жизнеспособность культивируемых МСК костного мозга крыс
3.3.4 Влияние аноксии на иммунофенотип культивируемых МСК костного мозга крыс
3.3.5 Влияние аноксии на способность МСК костного мозга крыс к дифференцировке i vi
3.5 Пониженное содержание кислорода и транскрипционный фактор в культивируемых МСК костного мозга крыс
Заключение
Список литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФК активные формы кислорода ДМСО диметилсульфоксид
МСК мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, или мезенхимальные
стромальные клеткипредшественники, или мезенхимальные стволовые клетки
ЩФ щелочная фосфатаза
ВгсИМ бромдезоксиуридин
РИС флюоресцеинизотиоционат
РЕ фикоэритрин
Ркиназа фосфатидилинозитол3киназа
БАРкиназы стресс активируемые киназы семейства митогенактивируемых киназ МАРкиназ
ВВЕДЕНИЕ


При более низкой плотности посадки клеток на см2 мелкие веретеновидные клетки сменялись на 5 день культивирования сначала более крупными клетками, а затем, на 8 день, еще более распластанными клетками. При большей плотности посадки клеток клеток на см2 такая смена происходила на 2 и 5 день соответственно. При промежуточных плотностях посадки переход от одного доминирующего клеточного типа к другому происходил на и дни соответственно. То есть наиболее мелкие веретеновидные клетки персистировали в культуре как доминирующий тип дольше при меньшей плотности посадки, а более крупные клетки появлялись позже. Обратное наблюдалось при большей плотности площади посадки. Согласно определению, стволовая клетка должна обладать высоким пролиферативным потенциалом. Известно, что дифференцированные клетки в культуре могут пролиферировать ограниченное количество времени, давая никак не более удвоений популяции предел Хейфлика Хейфлик, . Очевидно, что большее количество удвоений популяции следует рассматривать как неординарную пролиферативную способность. Одной из важнейших характеристик МСК является их высокий пролиферативный потенциал без потери теломеразной активности и изменения кариотила i, i, , i, , . Действительно, МСК из костного мозга способны к самоподдержанию в культуре в течение достаточно длительного времени. По различным источникам количество удвоений популяций, которое они претерпевали, составляет от до 0 , i, , , i, . Различные культуры МСК даже в пределах одного вида демонстрируют разную способность к длительному самоподдержанию. Так, для МСК из костного мозга человека в одной из работ было показано, что некоторые культуры поддерживались i vi, давая более чем удвоений популяции, пролиферативная активность других останавливалась уже после 4 удвоений численности популяции. Интересно, что репликативный потенциал кореллировал со способностью клеток ранних пассажей образовывать колонии при начальной низкой плотности посадки. В другой работе было продемонстрировано, что МСК из костного мозга человека характеризовались разной способностью к самоподдержанию в зависимости от плотности посадки при культивировании, и число удвоений варьировало в пределах от до и более , , ii . При исследовании МСК из костного мозга мышей было показано, что стромальные клетки, полученные от пяти разных линий мышей различались по количеству получаемых МСК в первичной культуре, способности к длительной пролиферации и кинетике пролиферации i, , I . Другими исследователями отмечается слабая пролиферативная активность МСК из костного мозга мышей, а также трудности с их получением и культивированием , , ii . Таким образом, МСК, даже у животных одного вида, демонстрируют различный пролиферативный потенциал. Факторы, определяющие вариабельность в максимальном числе удвоений популяции МСК, не определены и требуют дальнейшего изучения. Интересно, что наблюдаемая i vi гетерогенность МСК не ограничивается только морфологическими характеристиками, но затрагивает также пролиферативную активность этих клеток. Так, клетки веретеновидной формы пролиферируют в культуре активно. Крупные, распластанные клетки обладают низким пролиферативным потенциалом и делятся медленно. Наиболее активно пролиферирующими клетками являются мелкие клетки , i, , . Полная характеристика пролиферативного потенциала МСК включает также кинетику пролиферации этих клеток. Типичная картина пролиферативной активности МСК включает несколько стадий фазу, фазу и стадию плато Паюшина, Домарацкая, Старостин, , i, , , , ii . В течение первой фазы фазы не наблюдается активного деления клеток. В течение второй фазы фазы имеет место высокая пролиферативная активность клеток. Характеристикой этой фазы роста является время удвоения популяции. На следующей стадии происходит замедление роста культуры МСК за счет контактного торможения при образовании монослоя плато. Характеристиками этой фазы могут являться время ее наступления, а также прирост количества клеток по сравнению с начальным количеством клеток, посаженных на пластик.