Участие активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола

• Автор: Науменко, Екатерина Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 128 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Трансформация 2,4,6тринитротолуола ТНТ

1.1.1. Аэробная трансформация ТНТ микроорганизмами

1.1.2. Трансформация ТНТ растениями

1.2. Токсичность и мутагенная активность ТНТ и его метаболитов

1.2.1. Токсические эффекты ТНТ

1.2.2. Мутагенная активность ТНТ и его метаболитов

1.3. Биологические эффекты активных форм кислорода АФК

1.3.1. Характеристика основных типов АФК, механизмы их
образования в организмах разного эволюционного уровня
1.3.2. Методы определения АФК в биологических системах
1.4. Транспорт железа сидерофоры, железоредуктазная активность.
Роль железа в развитии патологических состояний
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы и реагенты
2.2. Бактериальные штаммы и культура растительной ткани
2.3. Определение видовой принадлежности бактериальных
штаммов
2.3.1. Выделение геномной ДНК
2.3.2. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.3.3. Секвенирование продукта ПЦР
2.4. Трансформация ТНТ
2.4.1. Трансформация ТНТ клеточными суспензиями бактерий
2.4. 2. Трансформация ТНТ клеточной суспензией каллусной ткани .
2.4.3. Трансформация ТНТ ферроцианидом
2.4.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ
продуктов трансформации ТНТ
2.5. Определение потребления кислорода клеточными суспензиями
2.6. Определение активных форм кислорода АФК.
2.6.1. Определение супероксидного анионрадикала Ог
адренохромным методом
2.6.2. ЭПРсиектроскопия АФК.
2.7. Определение физиологического статуса бактериальных и растительных клеток в процессе трансформации ТНТ.
2.7.1. Определение клеточной проницаемости методом
флуоресцентного окрашивания
2.7.2. Определение жизнеспособности клеток культуральными методами.
2.8. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Выделение и идентификация микроорганизмов.
3.1.1. Выделение бактериальных штаммов и определение их родовой принадлежности.
3.1.2. Видовая идентификация штаммов.
3.2. Трансформация ТНТ клеточными суспензиями
3.2.1. Трансформация ТНТ интактными бактериальными клетками
3.2.2. Трансформация ТНТ термически инактивированными
бактериальными клетками
3.2.3. Трансформация ТНТ клетками гречихи татарской Раоругит
Шапсит Ь. ОаеПп.
3.3. Потребление кислорода суспензией бактериальных клеток.
3.4. Образование АФК в процессе трансформации ТНТ
3.4.1. Внеклеточная продукция АФК в процессе микробной трансформации ТНТ
3.4.2. Образование АФК в процессе трансформации ТНТ культивируемыми клетками К Шапсит.
3.5. Оценка роли ионов железа в трансформации ТНТ и образовании АФК
3.5.1. Влияние хелатирующих агентов на биотрансформацию ТНТ и образование АФК
3.5.2. Небиологическая трансформация ТНТ ферроциаиидом К4РеСН6
3.6. Функциональные изменения клеток в процессе трансформации ТНТ
3.6.1. Оценка физиологического состояния клеток методом флуоресцентного окрашивания
3.6.2. Определение жизнеспособности клеток В. сегеш и Р. аагсит
культуральным методом
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ЛИТЕРАТУРА


Среди нитроароматических соединений наибольшее распространение получил 2,4,6тринитротолуол ТНТ, который несколько десятилетий использовался в качестве основного компонента взрывчатых смесей. Широкое применение ТИТ в ходе двух мировых войн привело к загрязнению наземных и водных экосистем. В частности, обширному загрязнению подверглись территории Германии и США. Адриатического моря в ходе недавнего конфликта в Косово . Токсичность и его метаболитов показана в различных тестсистемах, от клеток бактерий до млекопитающих . Нитроарилы, в том числе ТНТ, выступают как причина апластической анемии, нарушений функций печени, развития катаракты. Кроме того, показана мутагенная активность ТНТ и его метаболитов по отношению к микроорганизмам и культурам клеток млекопитающих. Абсолютное большинство микроорганизмов способно тем или иным образом воздействовать на молекулу ТНТ. Наиболее распространенным путем микробной трансформации данного соединения в аэробных условиях является последовательный двухэлектронный восстановительный механизм, приводящий к превращению нитрогруппы через нитрозо и гидроксиламинов аминогруппу. Наиболее полная восстановительная трансформация ТНТ до триаминотолуола выявлена только у строго анаэробных микроорганизмов . , . В аэробных условиях для подавляющего большинства микроорганизмов наиболее характерно образование изомерных ГАДНТ в качестве основных метаболитов ТНТ и отсутствие дальнейшего их масштабного восстановления до моноамииопроизводных. Возможно почти стехиометрическое восстановление ТНТ в ГАДНТ представителями родов i Наумов с соавг. Зарипов с соавт. Вопрос о возможности одноэлектронпого восстановления ТНТ в литературе предполагается с участием кислородчувствительной нитроредуктазы, исходным донором электронов для которой является , а разобщение двухэлектронного потока происходит на уровне флавинов i, . ТНТ, рассматривает либо восстановление его нитрогрупп, либо гидридное восстановление ароматического кольца. В то же время практически отсутствуют сведения о вовлечении кислорода в данный процесс и связанное с ним образование активных форм кислорода АФК в системе ТНТбактериальные клетки. Цель и задачи исследования. Цель данной работы охарактеризовать участие активных форм кислорода в процессе трансформации 2,4,6тринитротолуола клетками различного уровня организации. Научная новизна. АФК. Проведено детальное изучение качественных и количественных характеристик образования кислородных радикалов на начальном этапе трансформации ТНТ у микроорганизмов из различных физиологогаксономических групп. Показана генерация наиболее реактивной формы кислорода гидроксильного радикала при воздействии ТНТ на клеточную суспензию i , а также вторичное образование данного типа АФК на более поздних этапах трансформации ксенобиотика штаммом i . Впервые выявлена роль ТНТ как индуктора окислительного стресса в культуре клеток растений. С применением оригинального подхода с привлечением хелаторов и комплексного соединения железа получены приоритетные данные, свидетельствующие о роли ионов металлов с переменной валентностью в инициации трансформации ТНТ по пути одноэлектронного восстановления. В работе впервые охарактеризована роль клеточной поверхности бактерий и ассоциированных с ней переходных металлов в процессе трансформации ТНТ. Впервые при использовании метода двойного флуоресцентного окрашивания показано изменение проницаемости клеток различного уровня организации в ответ на воздействие ТНТ. Практическая значимость. Показанная в работе внеклеточная аккумуляция АФК на раннем этапе микробной трансформации ТНТ представляет интерес в связи с высокой токсичностью кислородных радикалов, представляющих опасность окисления мембранных липидов, а также фрагментации ДНК, развитии воспаления, повреждения сосудов. Обнаруженное нами образование АФК клеточными суспензиями при контакте с ТНТ может вносить решающий вклад в проявление токсических и генотоксических эффектов ТНТ в отношении организмов разного эволюционного уровня.