Термоадаптация умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense O-12

• Автор: Медведкова, Ксения Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 148 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Особенности биологии термофильных метанотрофов.

1.1. Экология и физиология

1.2. Общая характеристика термофильных метанотрофов

1.3. Метаболизм

1.3.1. Метанмонооксигеназа, се роль и регуляция

1.3.2. Ассимиляция соединений.

1.3.3. Пути ассимиляции азота

1.3.4. Биосинтез стеролов

1.4. Геномные реконструкции метаболизма iii i.
Глава 2. Особенности адаптации термофильных и термотолерантных прокариот.
2.1. Тепловой шок
2.2. Особенности внутриклеточных структур у термофилов.
2.2.1. Белки и ферменты термофилов.
2.2.2. Механизмы стабилизации нуклеогидов
2.2.3. Внутриклеточные факторы, стабилизирующие белки и ДНК
2.2.3.1. Анионные термопротекторы
2.2.3.2. Незаряженные осмолиты.
2.2.4. Строение цитоплазматических мембран термофильных бактерий.
2.2.5. Системы антиоксидантной защиты у микроорганизмов
Глава 3. Пигменты метанотрофов.
3.1. Биосинтез меланинов у микроорганизмов.
3.2. Функции меланина и факторы влияющие на меланогенез
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. Материалы и методы
4.1. Объекты исследования
4.2. Культивирование метанотрофов
4.3. Микроскопические исследования.
4.3.1. Выявление нуклеоида в целых клетках.
4.4. Изучение физиологических свойств
4.5. Аналитические определения.
4.6. Идентификация органических осмолитов
4.6.1. Аминокислотный анализ.
4.6.2. Ионообменная тонкослойная хроматография.
4.6.3. Экстракция термостабильных низкомолекулярных растворимых веществ из клеток.
4.6.4. Разделение углеводсодержащих низкомолекулярных веществ
4.7. Определение включения суспензиями клеток.
4.8. Определение влияния температуры инкубации на биосинтез белка и окисление метана.
4.9. Фракционирование клеток
4.9.1. Получение бесклеточных экстрактов.
4.9.2. Определение концентрации белка
4.9.3. Электрофорез в ДСНПААГ.
4 Определение активности ферментов.
. Определение активности ферментов первичного и центрального метаболизма .
. Определение оптимальной температуры для активности ферментов.
. Определение термостабилизирующего влияния экстракта, спиртоводорастворимой фракции клеток штамма 0 и сахарозы на активность ЛДГ и ФДГ
4 Выделение ароматических метаболитов из культуральной жидкости
4 Выделение и изучение свойств меланина
4 Визуализация перекись разлагающей активности клеток . i 0.
4 Молекулярногенетические методы
. Выделение и очистка препаратов ДНК.
. ПЦРамплификация.
. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
. Очистка фрагментов ДНК.
. Лигирование фрагментов ДНК.
. Получение компетентных клеток и их трансформация.
. Выделение плазмид из рекомбинант пых клонов
Глава 5. Результаты и обсуждение.
5.1. Цитофизиологичсские и биохимические свойствами, i
5.1.1. Особенности роста . i 0 при различных температурах.
5.1.2. Окисление и ассимиляция метана при разных температурах культивирования адаптированными клетками . i
5.1.3. Влияние температуры инкубации на биосинтез белка . i 0.
5.1.4. Цитологические особенности . i 0.
5.1.5. Фосфолипидные и жирнокислотные профили клеток . i 0 и Мс. .
5.1.6. Влияние температуры культивирования на активность ферментов первичного и центрального метаболизма.
5.1.7. Влияние температуры измерения на активность ключевых ферментов i
метаболизма
5.2. Идентификация органических термопротекторов у . i
5.2.1. Накопление и путь биосинтеза сахарозы у . i
5.2.2. Влияние сахарозы на термостабильность ФДГ и ЛДГ.
5.3. Системы защиты от активных форм кислорода у термотолерантного и умеренно термофильного метанотрофов
5.3.1. Активности ферментов защиты от АФК.
5.4. Синтез меланинового пигмента . i
5.4.1. Выделение и изучение свойств меланинового пигмента.
5.4.2. Изучение локализации меланина в клетках . i 0.
5.4.3. Поиск предшественника синтеза меланина.
5.4.4. Расшифровка путей синтеза меланина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Поскольку в состав гидротермальных флюидов наряду с сероводородом входит заметное количество метана, высказывались предположения о наличии в этих зонах термотолерантныхтермофильных метанотрофов. Растворимость метана и кислорода в воде падает с повышением температуры, что может ограничивать рост метанотрофов, однако установлено, что растворимость газов в природных водах с низкой ионной силой менее 0 мМ снижается только на треть при повышении температуры от до С . Этим объясняется наличие процесса метанокисления в различных природных местообитаниях с повышенными температурами в гидротермальных районах Тихого океана Гальченко, . Кроме того, из термальных источников Венгрии и Японии были выделены термофильные виды рода i, , . Забайкалья термотолерантный представитель рода i Цыренжапова с соавт. Совсем недавно в разных географических зонах были выделены термоацидофильные облигатные метанотрофы, отнесенные к филуму Vii, растущие до С. Так, iiixi V, выделен из грязевого вулкана Солфата вблизи Неаполя Южная Италия. Подобные вулканы фумаролы, характеризуются значительными эмиссиями СН4 1 3 тгод в атмосферу, а показатели и варьируют от умеренной температуры и нейтрального до высокой и низкого . Новый облигатный термоацидофильный метанотроф i 4 был выделен из почвенного горизонта см, 4,5, С в Новой Зеландии, а изолят i из кислого термального источника на Камчатке i . I . Установлено, что метанотрофы находятся в симбиотических отношениях с различными беспозвоночными моллюсками и губками, обитающими у гидротермальных выходов и холодных ключей на дне морей и океанов i . Метанотрофы, наряду с сульфидокисляющими бактериями, располагаются в специальных клеткахбактериоцитах жабр . СО2, СН4, О2, поступающими из гидротерм, а бактерии, в свою очередь, фиксируют углерод, снабжая хозяина углеводами. Наряду с природными, существуют термальные экосистемы, созданные человеком. Отходы животноводческих ферм, такие как компост, навоз и силос, богаты органическим веществом и представляют собой своеобразный природный ферментер для аборигенной микрофлоры. Интенсивные микробиологические процессы разложения органики и образования метана происходят с выделением большого количества тепла. Германии . Ешинимаев с соавт. Однако структурнофункциональные особенности их термоадаптации не изучены. Таблица 1. Современная классификация аэробных метанотрофов , , . Термотолерантные штаммы x и имеют ВЦМ I морфотипа. Способны расти при температуре от до СС, оптимально при С. Обладают как растворимой, так и мембранной формами ММО. Реализуют, наряду с доминирующим РМФ циклом, минорные сериновый и РБФ пути ассимиляции. ЦТК неполный изза отсутствия активности акетоглутаратдегидрогеназы. Ассимилируют аммонийный азот посредством аминирования пиру вата с участием аланиндегидрогеназы и через глутаматный цикл ii , . Эти свойства, наряду с высоким содержанием ГЦ в ДНК мол , более характерным для метанотрофов II типа, послужили основанием выделить Мс. X мстанотрофных бактерий. Этот вид метанотрофов рассматривается в качестве своеобразного микробного Розетгского камня в метилотрофии и является одним из основных объектов молекулярногенетических исследований , , . Клетки . На минеральносолевой агаризованной среде развиваются в виде белых или . Водорастворимый пигмент не образуют. В качестве источника углерода и энергии используют только метан или метанол 0, . Способны индуцировать экспрессию гена нитрогеназы i и фиксировать атмосферный азот . Кравченко и др. Клетки Мс. ФЭА , КЛ 5,8 и ФГ и ФХ, уровень которых изменяется в зависимости от условий роста , , Гальченко и др. Гальченко, и метилированные производные фосфатидилэтаноламина фосфатидилмонометилэтаноламин ФММЭА и фосфатидилдиметилэтаноламин ФДМЭ, отсутствуют. Преобладающими жирными кислотами являются 1со7с и 0 . Гальченко . Род . Виды этого рода были охарактеризованы главным образом генотипически, они отличаются от но последовательности рДНК сходства. В результате авторами был реклассифицирован уже известный, но описанный только фенотипически вид ii V как i, и предложены два новых вида . Виды рода характеризуются плеоморфизмом вариабельностью морфологии клеток.