ПЦР_детекция вирусов и бактерий, взаимодействие нуклеиновых кислот микроорганизмов с противомикробными и противоопухолевыми препаратами

• Автор: Лиманский, Александр Петрович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Харьков
• Количество страниц: 164 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Раздел L АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
l. Общие сведения о плавлении нуклеиновых кислот
1.1.1. Методы исследования плавления ДНК
1.1.2. Профиль плавления, его характеристики
1.1.3. Плавление ДНК как метод исследования особенностей нуклеотидной последовательности
1.1.4. Тонкая структура профилей плавления ДНК
1.2. Полимеразная цепная реакция
1.2.1. Механизм Г1ЦР
1.2.2. Использование ПЦР для детекции инфекционных возбудителей
1.2.3. Анализ ПЦР тест-систем для детекции BLV
1.2.4. Анализ ПЦР тест-систем для детекции CMV
1.2.5. Правила проведения ПЦР-диагностики
1.3. Комплексы нуклеиновых кислот с биологически активными соединениями и антибиотиками
1.3.1. Механизмы взаимодействия антибиотиков с нуклеиновыми кислотами
1.3.2. Методы исследования взаимодействия нуклеиновая кислота - лиганд
1.3.3. Специфичность взаимодействия полинуклеотидов с антибиотиками
Раздел 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Компьютерный анализ геномов из баз данных EMBL/GenBank
2.2. Полимеразная цепная реакция
2.2.1. Подготовка клинического материала
2.2.2. Проведение амплификации
2.2.3. Визуализация амплифицированного продукта
2.3. Плавление ДНК
2.3.1. Термостатированная камера
2.3.2. Измерение температуры
2.3.3. Установка для плавления ДНК
2.3.4. Получение дифференциальных профилей плавления
2.4. Нуклеиновые кислоты
2.4.1. ДНК микроорганизмов
2.4.2. Полинуклеотиды
2.4.3. Плазмидная ДНК рАОЗ известной последовательности
2.4.4. Буферные растворы
2.5. Спектральные исследования комплексов ДНК-лиганд
2.5.1. Приготовление комплексов ДНК-лиганд
2.5.2. Спектрофотометрическое титрование
2.5.3. Расчет констант ассоциации ДНК с лигандами
Раздел 3. ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ И ВИРУСНОЙ ЭТИОЛОГИИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
3.1. Neisseria meningitidis
3.2. Cytomegalovirus
3.3. Bovine leukemia vims
3.4. Вирусы гепатита В, С
Раздел 4. КОМПЛЕКСЫ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ И АКРИДИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ
4.1. Комплексы акрихина и 9-аминоакридина с ДНК Calf thymus и Salmon sperm при pH 5,20-6,
4.2. Комплексы акрихина и 9-аминоакридина с ДНК

6. Оптимизация параметров ПЦР. Правильное определение температуры отжига позволяет значительно увеличить выход продукта реакции. Снижение Tan приводит к увеличению количества амплифицированного продукта, но в то же время и к росту неспецифичного синтеза.
7. Достижению максимально высокой чувствительности при самых простых методах индикации способствует проведение гнездовой амплификации: сначала на протяжении 20-30 циклов происходит синтез с парой внешних праймеров первого ампликона; затем амплифицируется фрагмент меньшей длины с парой праймеров, комплементарных внутренней последовательности первого ампликона [73]. В модельных системах при детекции цитомегаловируса человека гнездовая ПЦР в сочетании с электрофорезом в ПААГ и окрашиванием бромистым этидием дает возможность уверенно регистрировать порядка 10 геномов в пробе. Граница чувствительности ПЦР-диагностикума инфекционных заболеваний (при условии использования 100 мкл клинического образца) - 100-1000 возбудителей в 1 мл. Такая чувствительность достигается только при использовании культуральных методов детекции [78, 79].
Однако кардинально увеличить выход продукта ПЦР с помощью вышеперечисленных мер невозможно. Проведенный нами анализ профилей плавления праймеров и продукта показывает, что существенное увеличение выхода продукта ПЦР может быть достигнуто в случае максимального сближения температур плавления праймеров и продукта. Максимальное количество молекул праймеров будет связано с молекулами продукта при равенстве Ттпраим и Ттпрод. Из литературы и собственного экспериментального материала по взаимодействию нуклеиновых кислот с лекарственными соединениями [12, 80] известно, что молекулы-интеркаляторы стабилизируют двойную спираль ДНК, т.е. повышают ее температуру плавления. Акридиновые красители, антрациклиновые антибиотики, этидий бромистый и множество других лигандов можно использовать для стабилизации ДНК. Так, в работе [81] было исследовано влияние остатка ТЧ-(2-оксиэгил)-феназиния, ковалентно присоединенного к 3'- и 5'-концу гептануклеотида, на его комплексообразующие свойства с комплементарным