Теоретические и прикладные аспекты конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза

• Автор: Загоскина, Татьяна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 273 с. : 8 ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификация представителей рода .

1.2. Антигены бруцелл в связи с их диагностическим значением

1.3. Методы лабораторной диагностики бруцеллеза

1.4. Иммунохимичсские методы с использованием мембранных под

1.5. Коллоидные металлы в конструировании диагностических тест

систем

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов

2.2. Диагностический материал.
2.3. Микробиологические методы.
2.4. Препаративные методы.
2.5. Химические и физикохимические методы.
2.6. Иммунохимичсские методы
2.7. Серологические методы
2.8. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕННЫХ ФРАКЦИЙ БРУЦЕЛЛ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ
3.1. Выделение, очистка и характеристика физикохимических и
биологических свойств поверхностных антигенных фракций бруцелл .
3.2. Получение высокоактивных противобруцеллезных сывороток
для конструирования твердофазных иммунохимических тестсистем
ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТСИСТЕМ.
4.1. Иммуноферментный метод обнаружения антигенов бруцелл .
4.2. Сравнительная характеристика испытанных вариантов ИФА при обнаружении антигенов бруцелл
4.3. Применение иммунопероксидазного метода для обнаружения антигенов бруцелл.
4.4. Разработка ИФА для одновременного обнаружения антигенов
и бруцелл.
4.5. Обнаружение противобруцеллезных антител с помощью непрямого варианта ИФА.
4.6. Апробация ИФА при исследовании полевого и клинического материала
ГЛАВА 5. ИММУНОЭРИТРОАДСОРБЦИОННЫЙ МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ БРУЦЕЛЛ И АНТИТЕЛ К НИМ
5.1. Конструирование ИЭАМ для обнаружения антигенов бруцелл
5.2. Использование ИЭАМ для выявления антигенов бруцелл
5.3. Апробация конъюгата I3 в качестве антительного эритроцитарного диагностикума для РПГА.
5.4. Апробация ИЭАМ при исследовании клинического и полевого
материала.
ГЛАВА 6. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАЗРАБОТКИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТСИСТЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРА ИММУННЫХ РЕАГЕНТОВ ЧАСТИЦ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА.
6.1. Разработка дотиммуноанализа для выявления антигенов бруцелл с помощью конъюгата 3.
6.2 Разработка дотиммуноанализа с конъюгатом стафилококковый белок АКЗ для обнаружения Аг бруцелл
6.3. Дотиммуноанализ с конъюгатом АгКЗ для выявления противобруцеллезных антител
6.4. Апробация дотиммуноанализа при исследовании клинического
материала на бруцеллез.
ГЛАВА 7. ДОТИММУНОАНАЛИЗ С ЧАСТИЦАМИ КОЛЛОИДНОГО СЕРЕБРА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ БРУЦЕЛЛ И АНТИТЕЛ
К НИМ.
7.1. Теоретические и методические основы использования коллоидного серебра в качестве маркера иммунных реагентов
7.2. Разработка дотиммуноанализа для обнаружения антигенов бруцелл
7.3. Разработка дотиммуноанализа для обнаружения противобруцеллезных антител.
7.4. Дотиммуноанализ для обнаружения антител против бруцелл в Ьформе.
7.5. Апробация дотиммуноанализа при исследовании клинического
материала на бруцеллез.
ГЛАВА 8. ДОТИММУНОАНАЛИЗ С ЧАСТИЦАМИ УГЛЕРОДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫХ АНТИТЕЛ.
8.1. Конструирование диагностикума для обнаружения антител на основе антигена, меченного активированным углем.
8.2. Дотиммуноанализ с угольным диагн ости кумом при исследовании кроличьих сывороток на бруцеллез
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА.
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
Аг антиген антигены
Ат антитело антитела
БА белок А стафилококка
бдН бидистиллированная вода
БСА бычий сьшороточный альбумин
БИМ белки наружной мембраны
БПА белковополисахаридный антиген
ГА глутаровый альдегид
ДТТ дитиотреитоловый тест
дмсо диметилсульфоксид
дн дистиллированная вода
дох дезоксихолат натрия
дпс деградированный липополисахарид
ДСН додецилсульфат натрия
ДСНПАГЭ дискэлектрофорез в полиакриламидном геле, содержащем ДСН
ЗФР забуференный физиологический раствор
ИБ иммуноблотинг
ИФА ЕША иммуноферментный анализ
ИФТ иммунофлуоресцентный тест
ИЭАМ иммуноэритроадсорбционный метод
ИЭФ иммуноэлектрофорез
КББ карбонатнобикарбонатньш буфер
КДО, КЕЮ кетодезоксиокгонат 2кетоЗдезоксиоктоновая кислота
КЗ коллоидное золото
кИФА конкурентный иммуноферментный анализ
КО клеточная оболочка
КОЕ колониеобразующая единица
КРС крупный рогатый скот
КС коллоидное серебро
КСт клеточная стенка
КТ кардтест
ЛПС, ЕРБ липополисахарид
мАт моноклональные антитела
2МЭ 2меркаптоэтанол
мэт меркаптоэтаноловый тест
м.к. микробные клетки
м.м. молекулярная масса
нг нативный гаптен
нИФА непрямой иммуноферментный анализ
НК нуклеиновые кислоты
нЛПС неочищенный ЛПС
НКС нормальная кроличья сыворотка
НДС нормальная лошадиная сыворотка
НМ наружная мембрана
НЦМ нитроцсллюлозная мембрана
опс Оспецифический полисахарид
ПААГ полиакриламидный гель
ПАФ полный адъювант Фрейнда
ПВИ поливинилимидазол
ПВП поливинилпирролидон
ПГ пептидогликан
ПрС протаминсульфат
ПХ пероксидаза хрена
ПЭГ полиэтиленгликоль
РА пробирочная реакция агглютинации, реакция Райта
РБТ РозБенгал тест
РДСК реакция длительного связывания комплемента
РК реакция Кумбса
РПГА реакция пассивной гемааглютинации
РСК реакция связывания комплемента
РХ реакция Хеддльсона
ТХУ трихлоруксусная кислота
ФР 0.9 раствор хлорида натрия
чЛПС чистый ЛПС
э эритроциты
ЭГТА этиленгликольбисаминоэфиртетрауксусная кислота
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
1вМ иммуноглобулины классов биМ
Ша кДа килодальтон
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Ат против общего специфического эпитопа ЛПС перекрестно реагируют с отдельными представителями семейств Епi и Vii. На ограниченное значение С и М эпитопов в серологической дифференциации В. Более того, для дифференциации иерсиниозной и бруцеллезной инфекций рекомендуется использовать не Аг бруцелл, а . В бывшем СССР и теперь в России в качестве коммерческого препарата для РА как пробирочной, так и пластинчатой наибольшее применение получил единый бруцеллезный диагности кум ЕБД стандартный Аг, подгитрованный по национальной стандартной агглютинирующей сыворотке Таран И. Ф., Лямкин Г. И., . За рубежом, а в последние годы и в России для постановки пластинчатых реакций РБТ, КТ применяется цельноклеточный диагностикум, но не нейтральной, как в случае ЕБД, а резко кислой реакции i V x i i, . Предпринимались попытки использования цсльноклеточного Аг и в других диагностических тестах РСК, ИФА, ДИА, однако они не получили развития, поскольку целые клетки давали наибольшее количество перекрестных реакций К. При диагностике инфекции, вызываемой В. В. i, рекомендовано применение антигенов, выделенных из бруцелл путем солевой в том числе горячей1 или водной экстракции . Vii . Фракция белковых бруцелл, экстрагированная солевым раствором, оказалась пригодной для использовании ее в ИФА Григорьева Г. И. и др. Имеются сообщения о применении в качестве диагностического Аг ультразвуковых дезинтегратов . Еще в начале х годов XX в. БНМ бруцелл. Необходимо, однако, учитывать, что НМ бруцелл по сравнению с аналогичной структурой других грамотрицательных бактерий обладает рядом отличительных свойств, которые особенно четко проявляются при экстрагировании и очистке ее основных компонентов. Так, В. В. ii не образуют сферопласты при воздействии на клетку трисбуфсра и ЭДТА неионные детергенты при экс тракции белков из бруцелл менее эффективны, чем в случае . НМ бруцелл необходима предварительная ее обработка лизоцимом который, как известно, разрушает ПГ. Таким образом, в НМ бруцелл существует значительно более сильное, чем у других бактерий, взаимодействие компонентов белков и липидов между собой, с ЛПС и ПГ за счет гидрофобных и частично ковалентных связей i I. В экстрактах НМ В. В. ii, В. В. i, полученных воздействием биполярных детергентов, установлено наличие трех групп протеинов м. Да . V . Протеины второй группы у всех штаммов по антигенной активности и составу аминокислот идентичны и по этим признакам близки протеину . Протеины 3й группы представляют собой кислые гликопротеины, по антигенным свойствам и аминокислотному спектру идентичные у бруцелл разных видов . Ве . V . V , i , i , . Мембранные белки штаммов, выделенные экстракцией лаурилсаркозинатом или ионным детергентом, подразделены на два типа ИМ штаммов первого типа В. В. vi, В. НМ штаммов второй группы В. В цвитергентрастворимых фракциях большинства бруцелл выявлены Аг а, общий для групп 2 и 3, Аг Ъ, перекрестно реагирующий с протеинами . Аг с и , перекрестно реагирующие с протеинами В. V , i , . Протеины . ДСП, включали четыре компонента ЛПС, полипептиды м. Да и гликопротеид м. Да . В горячих солевых экстрактах и фракциях везикул НМ штаммов В. В. ii выявлены 5 основных групп протеинов, свободных от ЛПС белки м. А, . В, . С и . Д кДа. Профили белков из солевых экстрактов и везикул бруцелл обоих видов были сходны, а протеины групп А, В и С родственны протеинам группы 3 . В составе НМ бруцелл всех 6 видов и их биоваров идентифицированы минорные протеины м. Да, содержание которых, в отличие от мажорных, более вариабельно даже в клетках штаммов одного вида. В. vi по большей молекулярной массе протеина кДа отличается от бруцелл других видов. Сыворотки естественно инфицированных В. ИФА с этими протеинами давали положительные реакции, сыворотки вакцинированных животных отрицательные i . Эффективным средством выявления антигенной структуры бруцелл оказались мАт, с помощью которых . В. и В. НМ м. С учетом комплексных данных принято считать, что НМ бруцелл, помимо и ЛПС, включает три мажорных м. Да и четыре минорных , . Да V . В .