Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus Intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus Subtilis на разных фазах роста

• Автор: Михайлова, Екатерина Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 166 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные принципы классификации протеолнтических И ферментов

2. Сериновые протеиназы

2.1 Классификация сериновых протеиназ

2.2. Эволюция сериновых протеиназ

2.3. Субтилазы субтилизиноподобные сериновые протеиназы

2.4. Структура и механизм катализа субтилизиноподобных протеиназ

2.5. Свойства субтилизиноподобных протеиназ

2.6. Многообразие физиологических функций сериновых протеиназ
4. Применение субтилизиноподобных протеаз
5. Генная инженерия субтилизиноподобных протеаз бацилл
Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Объект исследования и условия его культивирования
2. Определение протеолитической активности
3. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма
4. Электрофорез в ПААГ
5. Массспектрометрический анализ МАЬПГТОЕ
6. Аминокислотный анализ
7. Определение субстратной специфичности
8. Влияние ингибиторов на активность субтилизиноподобной
протеиназы
9. Физикохимические и энзиматические свойства субтилизиноподобной протеиназы
. Спектральный анализ препаратов субтилизиноподобной
протеиназы
. Гельфильтрация
. Биоинформационный анализ
. Математическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Подбор питательной среды для эффективной продукции протеиназы i ii, секретируемой рекомбинантным штаммом i ii
2. Выделение и очистка и субтилизиноподобной протеиназы В.
ШегтейтЪ соответствующей разным стадиям роста рекомбинантного штамма
3. Массспектрометрический анализ
4. Анализ первичной структуры протеиназы
5. Влияние ингибиторов на активность протеиназы АргВ1
6. Субстратная специфичность препаратов фермента
7. Кинетические параметры
8. Температурный оптимум и термостабильность
9. рНоптимум и рНстабильность нротеиназ
. Стабильность препаратов протеиназы в присутствие различных агентов
. Спектральный анализ препаратов протеиназы В. 1ШеппеИ1, соответствующей разным стадиям роста
. Влияние ионов двухвалентных металлов на препараты протеиназы
. Гельфильтрация препаратов протеиназы, соответствующих 1 разным стадиям роста
. Электрофорез препаратов протеиназы в нативных условиях
. Гельфильтрация после исчерпывающего обессоливания 4 препаратов протеиназы В. ЫегтеШю
. Построение модели третичной структуры субтилизиноподобной
протеиназы В. ШегтеМт
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
I. Подбор среды культивирования, выделение и очистка 8 протеиназы, соответствующей разным стадий роста
II. Свойства препаратов протеиназы разных стадий роста
III. Особенности структуры протеиназы, секретируемой на разных 4 стадиях роста
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Молекула воды выступает в качестве нуклеофильного компонента реакции, связанного с двумя каталитическими остатками аспарагиновых кислот, представляющими собой центральный структурный компонент активного центра этих ферментов . Кашпаров с соавт. Эти ферменты ингибируются реагентом на карбоксильные группы пепстатином. Они редко встречаются у бактерий, но преобладают у грибов родов i, iii, i и др. Группа металлопротеиназ весьма многочисленна и разнообразна как по размерам и свойствам, так и но их функциональной специфичности. Так, к этой группе относятся коллагеназы, геморраргические токсины змей, термостабильные белки бактерий v . i . , . Известно семейств металлопротеаз, включающих семейств экзо, эндопептидаз и семейство, включающее обе группы ферментов. Все они содержат ион металла в активном центре. Семейства делятся на кланы на основании аминокислотной последовательности, составляющей металлсвязывающий сайт. Кроме того, специфичность действия обусловливает разделение на 4 группы нейтральные, щелочные и x I и x II. Все они ингибируются хелатирующими агентами. Молекулярная масса составляет кДа. Хорошо изученными металлопротеазами являются термолизин В. ii ii, i, эластаза i . ММГ1 эукариот, функция которых связана с обменом соединительнотканного матрикса в норме и при патологии. Доказано их в опухолевой трансформации, в процессах инвазии и метастазирования Соловьева, . Металлопротеазы используются при выделке кожи, предотвращения образования осадка в пиве, уменьшения содержания клейковины в муке, используемой для выпечки бисквитов и печенья Харвуд, . Выделяют семейств цистеиновых протеаз, активный центр которых представлен диадой i и i. Ферменты активны при нейтральных и кислых . Они инактивируются реагентами, взаимодействующими с тиоловыми группами пхлормеркурибензоатом ПХМБ, йодоацетатом, 2 и др. Эта группа протеиназ включает в себя ферменты, выделенные из клеток стрептококков, клостридий и некоторые патогенные белки , i. Наиболее распространенными и изученными являются цистеиновые протеиназы млекопитающих семейства папаина. Это группа гомологичных белков с однотипной трехмерной структурой. Отличия в специфичности обусловлены локальными различиями в структуре субстратсвязывающей области. Функции этих ферментов многоплановы и разнообразны. Имеются литературные данные о том, что лизосомные цистеиновые протеиназы вовлечены в процессы неопластической трансформации. Цистеиновые протеиназы деградируют многие белки и компоненты внеклеточного матрикса, осуществляют протеолиз короткоживущих белков, которые регулируют злокачественный рост. Важная роль в регуляции активности цистеиновых протеиназ принадлежит специфическим ингибиторам. Полагают, что изменение баланса цистеиновые протеиназы эндогенные ингибиторы способствует злокачественной прогрессии Дилакян, . Сериновые протеиназы найдены в организмах, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы вирусах, археях, бактериях, грибах и высших эукариотах. Среди сериновых протеаз есть как экзо, так и эндопептидазы. Мотив активного центра включает в себя , i и . Молекулярная масса большинства протеаз этой группы находится в пределах кДа, однако есть и исключения 6 кДа для протеазы i, кДа для протеазы i ii , кДа для субтилизина i . vi . . . Сериновые протеиназы функционируют в щелочной и нейтральной среде, чувствительны к специфическим ингибиторам, которые связываются с остатком серина в активном центре диизопропилфторфосфату , фенилметилсульфонилфториду , а также к различным природным ингибиторам микробного, растительного и животного происхождения. Они обладают широкой субстратной специфичностью, в том числе эстеролитической и амидазной активностью. Такой комплекс свойств, а также высокая устойчивость в широком интервале температур, позволяют находить им широкое применение в различных отраслях промышленности.