Структурно-функциональный анализ адгезивной вариабельности пилей первого типа уропатогенных штаммов Escherichia coli

• Автор: Тринчина, Елена Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль пилей первого типа в экологии микроорганизмов

1.1.1. Адгезии i как представитель класса лектинов

1.1.2. Роль пилей первого типа в адаптации микроорганизмов

1.1.3. Пили первого типа в историческом аспекте

1.2. Современные представления о пилях первого типа . i

1.2.1. Морфология и структура пилей первого типа

1.2.2. Структурные компоненты пилей первого типа

1.2.3. Генетическая структура iкластера. Строение, функция

отдельных генов в функционировании кластера
1.2.4. Регуляция экспрессии пилей первого типа
1.2.5. Биогенез фимбрии секреция и процессинг субъединиц,
сборка органеллы
1.2.6. Варианты рецепторной специфичности адгезина i
1.3. Структурнофункциональные свойства пилей первого типа
1.3.1. Фенотипическая гетерогенность i штаммов Е. со.
Взаимодействие с фибронектином.
1.3.2. Три варианта адгезивного фенотипа i.
1.3.3. Количественные разновидности в пределах Мфенотипа
1.3.4. Количественные различия, возникающие за счет
вариабельной способности связываться с одиночными маннозильными остатками
1.4. Роль вариантов i в тканевом тропизме
1.4.1. Прочность фиксации на МанБСА коррелирует с
результатами модельных опытов на уроэпителиальных клетках
1.4.2. Варианты БилН и количественные различия в связывании с
ассиметричными участками мембран уроэпителия i i
1.4.3. Варианты i, отличные по способности колонизировать мочевой пузырь мыши i viv . i
1.4.4. Мутации i, повышающие уровирулентность, препятствуют адгезии к клеткам орофарингеального
эпителия
1.5. Варианты РюпН и эволюция вирулентности
1.5.1. Филогенетический анализ аллелей РтИ
1.5.2. Патоадаптивные мутации
1.5.3. Значение и перспективы дальнейшего изучения адгезина
i пилей первого типа
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы микроорганизмов, плазмиды и конструкции
гибридов
2.2. Среды, антибиотики и реактивы, используемые в работе
2.2.1. Среды
2.2.2. Антибиотики
2.2.3. Реактивы
2.3. Методы исследования бакгериальной адгезии
2.3.1. Исследование агрегации дрожжей
2.3.2. Исследование агглютинации эритроцитов
2.3.3. Исследование роста , ИР
2.3.4. Обогащение культуры микроорганизмов
2.3.5. Радионуклеотидное исследование адгезии
2.3.6. Исследование адгезии к клеткам защечного Инвертированное исследование адгезии эпителия.
2.3.7. Исследование адгезии к эритроцитам в непрерывного потока условиях
2.3.8. Исследование адгезии к уроэпителиальным клеткам
2.4. Иммунологические методы
2.4.1. Взаимодействие i антител и неимунной сыворотки со
2.5. штаммами . i, экспрессирующими i Методы работы с ДНК.
2.5.1. Выделение плазмидной ДНК
2.5.2. Обработка ДНК
2.6. Методы введения генетического материала в клетку
2.6.1. Классическая кальциевая трансформация клеток .i
2.6.2. Электропорация
2.7. Метод управляемой молекулярной динамики
2.8. Математическая и статистическая обработка данных
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Сравнительный анализ адгезивных вариантов i
штаммов кишечной палочки. Выявление нового адгезивного фенотипа пилей первого типа.
3.1.1. Биологическая значимость структурнофункционального
анализа адгезина i
3.1.2. i гибриды и их связывание с олиго и
мономаннозными рецепторными субстратами
3.1.3. Чувствительность связывания с РНКазойБ и 1МБСА к
ингибированию метилаОманнопиранозидом
3.1.4. Свойства гибридных i адгезинов при
взаимодействии с эукариотическими клетками
3.1.5. Определение конфигурации рецепторсвязывающего сайта
1 Мспецифического адгезина.
3.1.6. Индуцирование 1М фенотипа i точечной мутацией
3.1.7. Проверка морфологии пилей первого типа и экспрессии
i мутантным клоном
3.1.8. Новый адгезивный фенотип для понимания роли
фенотипической гетерогенности i
3.2. Изучение адгезивных свойств пилей первого типа штаммов
ii i в условиях потока
3.2.2.
3.2.4.
3.2.6.
Физиологический смысл рецепторспецифической адгезии бактерий
Реакция агглютинации эритроцитов в статических и динамических условиях Связывание эритроцитов в камере непрерывного потока в зависимости от приложенной силы потока Моделирование конформационных изменений структуры Р1тН, вызванных приложенной силой Экспериментальное подтверждение корректности управляемого компьютерного моделирования Функциональное значение адгезии, усиливаемой потоком 3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Позднее было показано, что именно i играет принципиальную роль среди факторов уропатогенности . Адгезия кишечной палочки и других членов семейства i к поверхности мочевого пузыря составляет основу патогенеза заболеваний мочевыводящего тракта. Адгезия осуществляется благодаря пилям первого типа, или фимбриям, несущим специфический белок, адгезии i, способный узнавать структуру рецепторов эпителиальной ткани и осуществлять с ними взаимодействие. Способность адгезинов избирательно взаимодействовать с теми, или иными рецепторами, определяет тканевой тропизм патогенных вариантов кишечной палочки. Кроме того, существуют функциональные особенности адгезина i комменсальных штаммов, возникающие случайным образом точечные мутации. Такие мутации в гене i называют патоадаптивными. Эти мутации приводят к повышению патогенного потенциала штаммов кишечной палочки, в результате чего и микроорганизмы приобретают способность выходить за пределы первичной экологической ниши. Таким образом, очень важно определить эти особые адгезивные свойства, которые специфически обеспечивают энтеробактериальную патогенную диссеминацию. Специфичность адгезивных характеристик белковой молекулы i определяется е структурной конформацией, которая позволяет определенным аминокислотным остаткам взаимодействовать с рецептором или субстратом. Знание структурнофункциональных взаимоотношений в молекуле адгезина необходимо для понимания механизмов его взаимодействия с рецепторами, а именно, каким образом патоадаптивные мутации влияют на структуру сайта связывания адгезина, в какой части белка расположены и посредством каких механизмов регулируют его адгезивные свойства. Одним из путей предотвращения патологической колонизации . Поэтому подбор оптимальных условий для ингибирования является принципиальным. Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в изучении структурнофункциональных взаимоотношений в составе адгезивной субъединицы i на примере уропатогенных штаммов . Путем сайтнаправленного мутагенеза установить конфигурацию сайтрецепторной участка моновалентного гибридного адгезина. Изучить взаимодействие уропатогенных и комменсалопаразитических штаммов . Изучить роль механического воздействия на третичную структуру адгезина, использовав для получения ответа на поставленный вопрос управляемое компьютерное моделирование молекулярной динамики i, базой данных для которого послужат материалы, полученные в функциональных тестах, описывающих поведение генноинженерных вариантов i. Научная новизна. Впервые на примере гибридных конструкций адгезина i показана возможность создания 1М мономаннозного адгезивного фенотипа . ЗМсвязывающей способности. Иначе говоря, патогенные штаммы, приобретая 1 Мсвявывание и расширяя таким образом спектр рецепторной специфичности, не утрачивают ЗМадгезивностъ по причине ее физиологической значимости. Впервые проведен сравнительный анализ адгезивной способности комменсалопаразитических и патогенных штаммов . Впервые установлены фенотипические различия адгезивной способности штаммов различного происхождения с функциональной точки зрения. Представители нормальной флоры человека обладают потокозавиеимым фенотипом, т. Уропатогенные штаммы не меняют степени своей адгезивности к клеткаммишеням в зависимости от состояния окружающего потока. Впервые проведен структурнофункциональный анализ адгезивной молекулы i с использованием управляемого компьютерного моделирования и изучено действие силовых механических воздействий, приложенных к молекуле адгезина извне. Таким путем впервые показана возможность модулирования функциональных свойств молекулы адгезина и рассмотрены варианты конформационных изменений, возникающих в его структуре либо при введении определенных мутаций в ген i, либо под действием механической силы. Практическая значимость. Предложены варианты воздействия на процесс адгезии уропатогенных . Адгезии i является на сегодняшний день идеальной моделью для изучения структурнофункциональных связей в молекуле белка, его взаимоотношений с различными субстратами как органического, так и неорганического происхождения.