Изучение токсинопродуцирующей способности штаммов Vibrio cholerae 01 и Vibrio cholerae 0139 с помощью иммуноферментного анализа и культуры клеток

• Автор: Маркина, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Ростов-на-Дону
• Количество страниц: 139 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Глава 1. Обзор литерату ры

1.1 Современные представления о структуре холерного токсина.

1.2 Методы обнаружения холерогена i vi

1.3 Моноклональные антитела к холерному токсину.

Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Бактериальные штаммы и условия их выращивания.

2.2 Бактериальные токсины и антитоксические сыворотки.

2.3 Ганглиозиды.

2.4 Перевиваемые клеточные линии и их культивирование.
2.5 Лабораторные животные.
2.6 Гибридизация клеток.
2.7 Культивирование гибридом i viv и i vi.
2.8 Скрининг моноклональных антител в культуральных жидкостях гибридом
2.9 Клонирование гибридом.
2. Криоконсервирование
2. иммуноферментный анализ ИФЛ
2. дотиммунологический анализ ОМгДИА.
2. СНОиммуноферментный анализ СНОИФА
2. Сэндвичиммуноферментный анализ двойных антител ИФА2АТ
2. Тест в культуре клеток.
2. Иммуноблоггинг препаратов холерного токсина
2. Фотографирование.
2. Статистическая обработка результатов.
Глава 3. Монослойныс клеточные линии в тестировании холерного токсина
3.1 Характеристика препаратов X и антитоксических сывороток
3.2 Особенности тестированиясупернатантов сЬс штаммов У.скоегае ,
У.сИокте и У.скокгае поп поп 0
в культуре клеток СН0К1
3.3 Тестирование супернатантов сЬс штаммов У.сИокгае в
культуре клеток
Глава 4. Варианты иммуноферментного метода для выявления
холерогена с использованием ганглиозидов вМ и поликлональных
антитоксических сывороток
4.1 Применение варианта СМ1ИФА для обнаружения и количественного определения ХТ
4.2 Отработка условий постановки дотиммунологического анализа ДИА с использованием ганглиозидов
вМ1 и нитроцеллюлозной мембраны
4.3 Разработка твердофазного СНОИФА для обнаружения ХТ
Глава 5. Получение и характеристика моноклональных антител
к холерному токсину
5.1 Получение гибридом продуцентов МКА к ХТ и их
первичный скрининг
5.2 Определение эпигопной направленности моноклональных
антител к ХТ.
5.3 Определение класса и подкласса моноклональных антител
5.4 Изучение специфичности и активности МКА к ХТ.
5.5 Токсиннсйтрализующие свойства МКА
5.6 Получение препаративных количеств МКА
5.7 Изучение способности МКА взаимодействовать с ХТ после его связывания с ганглиозидами 0М1
5.8 Разработка ИФА с использованием МКА к холерному токсину ИФА2АТ.
5.9 Оценка чувствительности различных вариантов ИФА
5. Изучение влияния различных биологически
активных веществ на специфичность ИФА.
Глава 6. Аспекты применения методов i vi для тестирования холерного токсина
6.1 Культура клеток в изучении биологической активности токсинов V., продуцируемых рекомбинантными штаммами
ii i
6.2. Изучение влияния условий хранения и обеззараживания препаратов холерогена на его активность с помощью ИФА и культуры клеток IЮК1
6.3 Влияние условий культивирования на токсинопродуцирующую активность штаммов V. и V.
6.4 Оценка качества очистки препаратов ХТ с использованием МКА
Заключение
Выводы.
Список литературы


Впервые для тестирования ХТ отработан новый вариант СНОИФА на основе клеток монослойной линии СН0К1, богатых ганглиозидами, с чувст вительностью около 1 м кгмл. Созданы гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела классов О и М, направленные к эпитопам Всубъединицы ХТ, расположенным вблизи ганглиозид связывающего участка и блокирующие взаимодействие ХГ с рецептором СМ1. В результате целенаправленного скрининга отобраны моноспецифические антитела, в большей степени отвечающие диагностическим требованиям ИФА, на основе которых отработан и оптимизирован ИФА2АТ с чувствительностью порядка нгмл. Анализ в иммуноблоте с помощью АТС, МКА к ХТ и МКА к Л ПС спектра белковых и углеводных компонентов супернатантов атоксигенных штаммов У. Иокгае и У. Иокгае , дающих ложноположительные результаты в ИФА, позволил выявить в их составе белковые соединения, вступающие в реакцию с антитоксическими антителами, повидимому, изза структурного сходства с отдельными эпитопами ХГ. Получены новые данные о токсинопродуцирующей способности штаммов V. V. из коллекции музея РостНИПЧИ. Среди них выявлены активные продуценты, отличающиеся высокой стабильной продукцией холерогена i vi независимо от срока их хранения. Впервые на монослойных перевиваемых клеточных линиях, имеющихся в Ростовском НИПЧИ, изучен биологический эффект дополнительных токсинов V. V. , продуцируемых штаммами ii i, несущими рекомбинантные плазмиды со вставками генов , , гемагглютининпротеазы. Установлены наиболее адекватные клеточные модели для их тестирования, а именно 9 и СН0К1 для изучения цитотонического фактора СеГ СПО i , СаСо2 токсина зонального поглощения xi, а , 9, , 2, тема ггл и и ротеазы. По материалам диссертации составлены и утверждены на Ученом совете РостНИПЧИ методические рекомендации Оценка способности холерных вибрионов продуцировать холерный токсин в условиях i vi протокол 8 от , которые могут быть использованы для оценки токсинонродупирующих свойств штаммов V. и V. Получены гибридомы продуценты МКА к X, из которых отобрано две, в большей степени отвечающие диагностическим требованиям иммуноферментного анализа. Штамм гибридомы 47, секретирующий МКД к X, депонирован в Специализированной коллекции культур клепок позвоночных Российской Коллекции клеточных культур 3 г. РККК П4Д. Линии СНОК1 и 9 использованы для отбора рекомбинантных штаммов . i . Штаммы . В, , , , экспрессирующие клонированные гены V. О обоих биоваров, V. НИПЧИ Микроб в качестве охраноспособных под номерами КМ 8, КМ 9, КМ0, КМ 1 . Различные варианты ИФА на основе ганглиозидов 1 и АТС IИФА, ДИА позволяют выявлять X с чувствительностью примерно и гмл. Полученные гибридомы продуцируют моноклональные антитела к субъединице X, специфичность которых подтверждена в ИФА, иммуноблоте и в тесте нейтрализации холсрогсна в культуре клеток СНОК1. На основе МКА к X, в большей степени отвечающих диагностическим требованиям иммуноферментиого анализа, разработан ИФА двойных антител ИФА2АТ с чувствительностью нгмл. Перевиваемые монослойные линии можно использовать для оценки биологического эффекта гемагглютининпротеазы и таких дополнительных токсинов V. V. как , наряду с клетками СНОК1, традиционно используемыми для обнаружения и количественного определения холерогена. Совместное применение культуры клеток и ИФА позволяет одновременно определить иммунохимическую и биологическую активность препаратов холсрогена, выявить наибольшее число токсинопролуцентов V. и V. Материалы диссертации были доложены на Всероссийских конференциях Гомеостаз и инфекционный процесс Саратов, на Международной конференции Идеи Пастера в борьбе с инфекциями С. Петербург, на конференции Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний Екатеринбург, на проблемных конференциях Холера и патогенные для человека вибрионы РостовнаДону, , .