Индукция ATM/ATR сигнального каскада в ответ на ДНК - повреждающее действие Helicobacter pylori

• Автор: Аникеенок, Марина Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 113 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Я. i.

1.1.1 История открытия Я. i

1.1.2 Характеристика Я. i

1.1.3 Распространение Я i

1.1.5 Основные гены, определяющие патогенность Я. i

1.1.5 Воспалительный процесс вызванный Я. i

1.2 Сигнальные пути, активируемые в клетке инфекцией Я i

1.2.1 Митоген активируемые МА протеинкиназы.
1.2.2 Белок
1.2.3 Фенотип колибри.
1.3 Я. i как индуктор развития аденокарциномы
1.3.1 индуцированное образование АФК и повреждение ДНК в клетках хозяина.
1.4 Активация каскада как индикатор повреждения ДНК.
1.4.1 киназа
1.4.2 Субстраты .
1.4.3 АТЯи ДНКПК.
Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1 Бактериальные штаммы и клеточные культуры.
2.2 Питательные среды и условия культивирования.
2.3 Используемые антитела.
2.4 Градиентный гель для электрофореза
2.5 Инфицирование.
2.6 Обработка агентами
2.7 Иммунологические методы.
2.7.1 Вестернблот анализ.
2.7.2 Двумерный электрофорез, окрашивание кумасси.
2.8 Оценка жизнеспособности клеток
2.9 Проточная цитометрия
2. Метод ДНКкомет
2. Массспектрометрия.
2. Статистическая обработка результатов.
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1 Активация ключевых киназ и в клетка и , инфицированных Я. i
3.1.1 Детекция активации и киназ методом иммуноблотинга .
3.1.2 Регистрация активации киназы методом проточной цитомстрии
3.2 Активация субстратов каскада , 2 и р
3.3 Выявление новых активированных субстратов киназ после инфекции Я. i
3.3.1 Регистрация активированных форм белков субстратов двумерным электрофорезом
3.3.2 Идентификация активированных белков методом массспектрометрии в клетках после инфицирования Н. i.
3.3.3 Исключение влияния ДНКПК на активацию А
3.4 Активация каскада митоген активированных киназ МА киназ и бактериального белка в присутствии и I, III ингибиторов методом иммуноблотинга.
3.5 Выявление повреждений ДНК в клетках и методом ДНКкомет после инфекции Я. i
3.6 Отсутствие индукции колибри фенотипа клеток при инфицировании Я i в присутствии и I, III ингибиторов
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Инфекция Я. i как возможный генотоксический агент
4.2 Молекулярнобиохимические изменения статуса клеткихозяина после инфицирования хеликобактером
4.3 Участие киназы в инициации митоген активированных МА киназ ответа клетки на стресс и формировании фенотипа
колибри
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Такие противоречия объясняются тем, что практически не изучено действие патогена непосредственно на ДНК хозяина и молекулярный статус клетки в отсутствии иммунных реакций, влияния другой микрофлоры и т. Понимание тонких молекулярных механизмов атаки . ДНК, а также влияния на сигнальные каскады клетки позволит правомерно говорить о данной бактерии как об опасном канцерогене. Актуальность таких исследований несомненна, а установление факта генотоксичности инфекции Н. Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось установление генотоксического потенциала Н. протеинкиназы и ее субстратов в ответ на инфекцию, вызванную данным патогеном в культуре клеток аденокарциномы желудка и карциномы эндометрия человека. Оценить генотоксический потенциал штаммов i i дикого типа и дефектного по островку патогенности ДРА1 прямым методом ДНКкомет. Установить возможность активации ключевых киназ атаксиятелеангиэктазия, мутантная , и относящаяся к атаксиителеангиэктазии клеточного ответа в ответ на двунитевые разрывы ДНК в клетках и после инфекции i i. Охарактеризовать спектр известных субстратов киназ, активированных инфекцией i i. Идентифицировать белки, фосфорилированные киназой после инфекции i i проанализировать степень активации ее известных субстратов и новых белков, впервые идентифицированных как субстраты киназы. Выявить возможное участие киназ и ДНКзависимой протеинкиназы ДНКПК в активации митоген активированных МА белков стрессового ответа и формировании фенотипа колибри. Научная новизна. Впервые получены данные об активации сигнального каскада, ключевого в ответе на появление двунитевых разрывов ДНК, после инфекции штаммами Н. Р дикого типа и мутанта Н. ДРА1, дефектного по островку патогенности, в культуре клеток аденокарциномы желудка и карциномы эндометрия человека . Впервые приведены результаты, указывающие на активацию целого ряда субстратов I киназы в ответ на инфицирование хеликобактером. С помощью молекулярных методов и методов биоинформатики впервые проведен системный анализ белков, фосфорилированньгх после инфицирования Н. В ходе работы идентифицированы новые, неизвестные субстраты киназы, фосфорилированные после инфицирования Н. . i I, что позволило показать наличие генотоксического потенциала бактерии вне зависимости от присутствия островка патогенности. Установлено, что киназа принимает участие в формировании фенотипа колибри, а также взаимодействует с внеклеточной сигналрегулируемой киназой белком стрессового ответа клетки. Представленные результаты вносят вклад в понимание роли инфекции Н. Практическая значимость. Проведенные исследования намечают новое направление в предотвращении развития онкологических патологий эпителиальной этиологии, связанных с инфекцией Н. Особое значение имеет обнаруженный факт наличия генотоксических изменений ДНК эпителиальных клеток при инфицировании штаммом Н. I, дефектным по островку патогенности и свидетельствующий об отсутствии связи повреждений ДНК эпителия человека и генетических детерминант патогенности, известных на сегодняшний день для хеликобактера. В ходе экспериментальной работы разработана и опробована оригинальная методика цитометрического определения фосфорилированной формы киназы, позволяющая оценить уровень активации киназ после инфицирования. Полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов клеточного ответа на инфекцию Я. , среди которых обнаружены не только известные белки клеточного цикла, но и новый сплайсинг фактор. Данные результаты имеют фундаментальное значение для развития молекулярнобиологических методов анализа и борьбы с инфекцией Н. Возможность идентификации активированных белков с помощью Iанализа после двухмерного электрофореза позволяет упростить и удешевить процедуру идентификации, исключив использование широкого спектра дорогостоящих антител.