Роль экстраклеточных структур агробактерий в контакте с поверхностью бактериальной и растительной клеток

• Автор: Волохина, Ирина Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Агробактериальная трансформация двудольных растений

1.2. Биология агробактерий

1.3. Этапы агробактериальной трансформации растений.

1.3.1. Хемотаксис и прикрепление агробактерий к стенке растительной клетки.

1.3.2. Белки и белковые структуры ризобий и агробактерий, участвующие в прикреплении к растительной клетке

1.3.3. Рецепторы на поверхности растительных клеток для прикрепления агробакгерий.

1.3.4. Экспрессия генов агробактсрий в ответ на растительные фенолы

1.3.5. Формирование Ткомплскса.
1.3.6. Выход ТДНК из бакгерии через угЯзависимый канал.
1.3.7. Перенос Ткомплекса в ядро растительной клетки, и встраивание ТДНК в геном растительной клетки.
1.3.8. Формирование опухоли.
1.4. Системы переноса ДНК у агробактерий
1.5. Общие черты процессов агробактериальной трансформации и бактериальной конъюгации
ГЛАВА . МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Штаммы и плазмиды, используемые в работе
2.2.1. Среды, условия культивирования
2.2.2. Растения
2.2.3. Приготовление экстрактов из растительных тканей.
2.2.4. Измерение количества прикрепившихся к корням пшеницы бактерий радиоизотоным методом.
2.2.5. Полуколичественное определение эффективности прикрепления бактерий к корневым волоскам растении с помощью световой микроскопии.
2.2.6. Электронная микроскопия.
2.2.6.1. Сканирующая электронная микроскопия.
2.2.6 2. Трансмиссионная электронная микроскопия.
2.2.7. Измерение концентрации клеток.
2.2.8. Выделение плазмидной ДИК
2.2.9. Метод иммунодота
2.2 Мечение целых клеток для просвечивающей электронной микроскопии
2.2 Подсчет трансконъюгантов при скрещивании агробактерий
2.2 Статистическая обработка результатов.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследование влияния фнзикохи.мических факторов на частоту переноса плазмиды рТс между агробакгериями.
3.1.1. Влияние ацетосирннгона и среды на перенос плазмиды рТс3
3.1.2. Влияние температуры скрещивания на частоту переноса плазмиды рТс между агробакгериями
3.1.3. Влияние центрифугирования, Б и блокиратора синтеза
белка КЦХГ на перенос плазмиды рТс между агробактериями .
3.2. Внеклеточные структуры агробактсрий, принимающие участие в
межклеточных контактах.
3.2.1. Локализация и идентификация цВ2зависимых структу р на
поверхности агробактерий.
3.2.2. Локализация и идентификация УцВ 1 зависимых структур на
поверхности агробактерий.
3 3. Прикрепление агробактерий с неиндуцированными уггенами к
корням и корневым волоскам пшеницы.
3.3.1. Динамика прикрепления агробактерий к поверхности корня пшеницы
3.3.2. Связь прикрепления агробактерий к поверхности корня пшеницы с наличием Пплазмиды.
3.4. Прикрепление агробакгерий с индуцированными уггенами к
поверхности корня и к корневым волоскам пшеницы
3.4.1. Влияние предобработки агробактерий экстрактом каланхос.
3.4.2. Влияние предобработки агробактерий ацетосирингоном на способность прикрепляться к поверхности корня и корневого волоска пшеницы
3.4.3. Влияние температуры выращивания и совместной инкубации на шзависимое и угнезависимое прикрепление агробактерий.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ л.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Хотя бактериальная конъюгация уже давно используется как модельная система для исследования процесса переноса высокомолекулярных нуклеиновых кислот через биологическую мембрану, структурная организация и механизм функционирования канала для переноса ДНК при конъюгации у бактерий, так же как и каната для переноса ТДНК при агроинфекции неизвестен. Цель работы изучение роли узависимых и угнезависимых экстраклсточных структур у агробактерий в процессах переноса ДНК в системах бактериябактерия и роли этих структур в установлении первичного контакта в системе бактериярастение. Определить влияние биохимических и физикохимических факторов на частоту переноса плазмиды рТс между агробакгериями. Локализовать угзависимые и унезависимые поверхностные структуры агробактерий, принимающие участие в межклеточных контактах. Изучить особенности прикрепления агробактерий индуцированными и не индуцированными уггенами к поверхности корня и корневых волосков пшеницы. Определить участие угзависимых поверхностных структур агробактерий в прикреплении к поверхности корня и корневых волосков пшеницы. Установлено влияние физикохимических факторов температура, среды, центрифугирования, обработка детергентом, на частоту переноса плазмиды рТбЗЗ между агробакгериями. Определены оптимальные условия для угзависимого переноса нсконъюгативной плазмиды рТ3. На поверхности агробактерий выявлены пилеподобные структуры, состоящие из ДгВ1 и У1гВ2белков. Обнаружено формирование шнезависимых экстраклеточных структур различной морфологии у агробактерий при конъюгации. Установлено участие мгзависимых белков, но не в УцВ2белка, процессе первичного контакта агробактерий с поверхностью кончиков корневых волосков, но не с клетками эпидермиса корня пшеницы. Впервые показана стимуляция адсорбционных свойств агробактерий под воздействием раневых эксудатов растений и ацетосириигона, и зависимость процесса адсорбции от температурных условии. Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышсвского. Результаты диссертационной работы использовались при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ. Методические рекомендации. Данные по исследованию влияния биохимических и физикохимических факторов на процесс агробактериальной трансформации были использованы для оптимизации метода трансформации растений сорго НИИСХ ЮгоВостока, г. Саратов. Специфическая индукция vгенов ацетосирингоном вызывает увеличение частоты переноса плазмиды между агробактериями при коныогативном процессе Физикохимические факторы температура, среды, механическое удаление, обработка детергентом изменяют частоту переноса плазмиды между агробактериями. Тиили, состоящие из УгВ2белка, локализованы на одном из полюсов клеток . Viбелок образует агрегаты на поверхности агробактерий Viбелок не обнаруживается в составе структур, при коньюгативном процессе. У фитопатогенных агробактерий при коныогативном процессе наблюдается образование vнезависимых экстраклеточных структур различной морфологии. Напфлион, Греция, Флоренция, Италия, 8м Международном Конгрессе по молекулярной биологии растительномикробного взаимодействия, Ноксвилл, США, Международном Симпозиуме по почвенной микробиологии Давос, Швейцария, Втором съезде биохимического общества Российской Академии наук Москва, м Международном Конгрессе по биохимии и молекулярной биологии СанФранциско, Калифорния, 7м Международном Конгрессе по фитопатологии Эдинбург, Шотландия, VIIой Конференции Новые направления биотехнологии Москва, 2м съезде биофизиков России Москва, Всероссийском Симпозиуме Изучение генома и генетическая трансформация растений Иркутск, школеконференции молодых ученых Горизонты физикохимической биологии Пущино, 5й школеконференции молодых ученых Биология наука века Пущино, на Международном симпозиуме Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнологии МоскваМинск, на ежегодных научных конференциях ИБФРМ РАН Саратов, . Диссертация состоит из введения и трех глав, в том числе обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 8 страницах, иллюстрирована рисунками и включает таблиц. Список использованных литературных источников включает 5 наименований, из них работы на русском языке и 2 англоязычных публикации.