Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста

• Автор: Шамсутдинов, Талгат Рахимзянович
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 127 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СП ИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Сериновые протеиназы микрорганизмов

1. Принципы классификации протсолитических ферментов

2. Общая характеристика сериновых протеиназ

3. Химотрипсииоподобные протеолитические ферменты бактерий

II. Глутамплэндопептидазыособое семейство хпмотрипсинов

1. Физикохимические свойства глутамилэндо пептидаз

микроорганизмов

2. Эволюционное биоразнообразие микробных глутамилэндопептидаз
3. Структурные особенности глутамилэндопептидаз бактерий
4. Механизм катализа глутамилэндопептидаз
5. Субстратная специфичность глутамилэндопептидаз
III. Регуляция биосинтеза глутамилэндопептидаз микроорганизмов
IV. Практическое применение глутамилэндопептидаз
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Штаммы и плазмиды
2. Выделение плазмидной ДНК
3. Электрофорез ДНК в агарозном геле
4. Трансформация клеток В. зиЫШэ плазмидной ДНК
5. Питательные среды
6. Культивирование бактерий
7. Определение белка
8. Определение протеолитической активности фермента
9. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма
. Электрофорез в ПААГ
. Массспектрометрический анализ МАЬОТОР
. Иммуноферментный анализ
. Определение субстратной специфичности
. Влияние ингибиторов на активность глутамилэндопептндазы
. Физикохимические свойства и кинетические характеристики глутамилэндопептндазы
. Энзиматические свойства глутамилэндопептндазы
. Математическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Динамика роста и накопления глутамилэндопептндазы в
культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. бнЫШб
2. Подбор питательной среды для эффективной продукции глутамилэндопептндазы В. ii, секретируемой рекомбинантным штаммом В. ii
3. Очистка глутамилэндопептндазы В. ii, секретируемой рекомбинантным штаммом В. ii на разных фазах роста и молекулярная масса белка
4. Иммунологический анализ препаратов глутамилэндопептндазы В, ii, секретируемой рекомбинантным штаммом В. ii
па разных фазах роста
5. Массспектрометрический анализ препаратов
6. Электрофорез препаратов глутамилэндопептндазы В. ii в нативных условиях
7. Влияние ингибиторов на активность препаратов
глутамилэндопептндазы В. ii
8. Субстратная специфичность фермента
9. Кинетические параметры глутамилэндопептндазы разных фаз
. оптимум и стабильность фермента
. Температурный оптимум и температурная стабильность фермента разных фаз роста
. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность глутамилэндопептидазы разных стадий роста
. Влияние дитиоэритритола на активность глутамилэндопептидазы разных фаз роста
. Влияние парахлормеркурибензоата и солей ртути на активность глутамилэндопептидазы разных фаз роста
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Целью работы явилось выделение, очистка и сравнительная характеристика глутамилэндопептидазы В. Подбор условий культивирования для выделения глутамилэндопептидазы В. В. ii на разных стадиях роста. Выделение и очистка глутамилэндопептидазы В. I анализ аминокислотных последовательностей глутамилэндопептидазы, соответствующей разным фазам роста. Сравнительное исследование свойств глутамилэндопептидазы, соответствующей разным стадиям роста. Выяснение роли дисульфидной связи в образовании конформеров глутамилэндопептидазы. Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована глутамилэндопептидаза В. В. ii на разных стадиях роста. Впервые проведена сравнительная характеристика свойств ранней и поздней глутамилэндопептидазы. Получены приоритетные данные о различии каталитических характеристик Кт и ксг1 ранней и поздней протеиназы. Сконцевые аминокислотные остатки совпадают. Впервые получены данные, указывающие, что поздний фермент содержит восстановленную дисульфидную связь в отличие от ранней глутамилэндо пептидазы. Сравнительные исследования позволили заключить, что наличие дисульфидной связи может определять велечину молекулярной активности глутамйлэндопептидазы разных фаз роста. Практическая значимость. Подобраны условия культивирования бактерий для эффективной продукции глутамйлэндопептидазы В. ШегтесИш на разных стадиях роста для проведения эффективной очистки фермента. Полученный в работе рекомбинантный штамм В. ЫШв может быть использован как эффективный продуцент глутамйлэндопептидазы. Результаты могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Результаты исследования свойств раннего и позднего фермента рекомбинантного штамма В. ЫШя позволит расширить наши представления о сериновых протеиназах, в частности, об особой подгруппе ферментов глутамилэндопептидазах. Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ гос. Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения. Исследования . РФФИ 2а, Академии наук РТ 3. Аналитической Ведомственной Целевой Федеральной. Программы РПП 2. Авторские исследования получили персональную поддержку Правительства Республики Татарстан г и были удостоены именной стипендии президента Республики Татарстан. Разработаны условия культивирования и получена глутамилэидопептидаза В. Глутамилэидопептидаза, разных фаз роста характеризуется идентичной аминокислотной последовательностью, но отличается по каталитическим характеристикам и энзиматическим свойствам. Дестабилизация глутамилэндопептидазы стадии позднего стационара по сравнению с соответствующим ферментом фазы замедления роста связана со статусом дисульфидной связи в белковой глобуле. Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях Материалы и технологии XXI века Казань, , , , школахконференциях молодых ученых Биология наука XXI века Пущино, , , Всероссийской научной конференции Ферменты микроорганизмов структура, функции, применение Казань, , V республиканской научнопрактической конференции молодых ученых и специалистов Наука. Инновации. Бизнес Казань, , Международной конференции аспирантов и молодых ученых Ломоносов, Москва, , , Материалах X1II международной научной студенческой конференции Студент и научнотехнический прогресс секция биология Новосибирск, , VI симпозиуме Химия протеолитических ферментов Москва, , Материалах докладов съезда с международным участием IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов Новосибирск, , Материалах XVI международной научной студенческой конференции Студент и научнотехнический прогресс Новосибирск, . Публикации По теме диссертации опубликовано научных работ.