Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения

• Автор: Шкопоров, Андрей Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 86 с. : 15 ил.

Содержание стр.

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Введение

1.2 Роль и место бактерий рода

iii в микробионснозе кишечника

1.3 Прикладное значение

бифидобактерий

1.4 Плазмиды у бифидобактерии

1.5 Создание челночных клонирующих векторов

для бифидобактерий ,

1.6 Направления прикладных генноинженерных
исследований с применением бифидобактерий
1.7 Регуляторные генетические элементы, необходимые
для экспрессии гетерологичных генов н бифидобактериях
1.8 Изучение сскрстируемых белков и
белковых адгезинов у бифидобактерий
Глава 2. Материалы и мет оды
2.1 Культивирование штаммов бактерий
2.2 Молекулярнобиологические и биохимические методы
2.2.1 Выделение геномной ДИК из бактериальных
и тканевых культур
2.2.2 Выделение плазмидных ДНК
2.2.3 Синтез ДИКолигонуклеотидов
2.2.4 Полимеразная цепная реакция
2.2.5 Обработка ДНК ферментами нуклеинового обмена
2.2.6 Ссквенирование плазмидных ДНК
2.2.7 Трансформация бактериальных шгаммов
2.2.8 Выделение тотальной РНК из бифидобактерий
2.2.9 Обратная транскрипция и ОГПЦР
в режиме реального времени
2.2. Электрофорез нуклеиновых кислот
2.2. Выделение секрстируемых белков бифидобактерий и иммуноблотгинг
2.3 Специальные биохимические методы
2.3.1 Видовая идентификация изолятов бифидобактерий методом секвенирования фрагмента гена рРНК
2.3.2 Ссквснированне плазмид, выделенных из штаммов бифидобактерий
2.4 Методы биоинформатики и компьютерной обработки данных
Глава 3. Собственные результаты
3.1 Поиск плазмидных ДНК в штаммах бифидобактерий
3.2 Определение полной нуклеотидной последовательности плазмид рВ и рВа
3.3 Анализ нуклеотидных последовательностей плазмид рВ и рВа
3.4 Конструирование челночных клонирующих векторов Е. i iii
3.5 Рекомбинантная экспрессия 1ена фактора роста фибробластов 2 человека в клетках В. v
3.6 Рекомбинантная экспрессия гена амилазы В. i в клетках В. v
3.7 Рекомбинантная экспрессия гена интерлейкина I человека в клетках В. v
Глава 4. Обсуждение полученных результатов Выводы
Список литературы


Определены и аннотированы полные нуклеотидные последовательности двух новых плазмид, в числе которых одна первая полностью просеквенированная плазмида из бифидобактерий вида iii ii, ii горам плазмида с нетипичным для бифидобактерий генным составом, напоминающая некоторые конъюгативные плазмиды бактерий рода . Продемонстрировано присутствие на описанных плазмидах генов, вовлеченных в процесс конъюгативпого переноса данных молекул ДНК. Отдельный интерес представляет присутствие на одной из плазмид набора генов на необходимых и достаточных, по всей видимости, для осуществления конъюгативного переноса данной плазмиды по уникальному с I рептомицстподобному механизму. На основе изученных плазмид создана серия челночных клонирующих векторов Е. iii, способных к автономной репликации в обоих типах хозяйских клеток и несущих соответствующие селективные маркерные гены для селекции в них. Продемонстрирована способность большей части полученных векторов к трансформации бифидобактерий вида iii v с относительно высокой эффективностью. Сконструированы экспрессирующие челночные вектора, несущие необходимые регуляторные элементы для обеспечения экспрессии гсгерологичных генов в бифидобактериях. Функциональность полученных плазмидных векторов была подтверждена при помощи трех модельных генов 2 человека, I человека и атуВ iii i. Кроме того, в случае с генами 2 и II, впервые была осуществлена гетсрологичная экспрессия человеческого гена в бактериях рода iii. Разработанные в ходе настоящего исследования челночные клонирующие вектора . iii, а также методы их доставки в клетки iii v имеют высокую практическую значимость. Данный инструментарий может быть использован для доставки и экспрессии гетерологичиых генов в клетках бифидобактерий как и рамках фундаментальных исследований, направленных на изучение биологии бифидобактерий, так и в рамках прикладных работ, имеющих целью получение пробиотических или биотерапсвтичсских штаммов бифидобактерий с новыми полезными свойствами. Полученные нами штаммы бифидобактерий, экспрессирующие и секрстирующис основной фактор роста фибробластов человека 2 и интерлейкин человека ИЛ, имеют как демонстрационное, так и самостоятельное прикладное значение. С учетом последних данных о возможности использования белков 2 и ИЛ для лечения различных тяжелых заболеваний желудочнокишечного тракта, указанные штаммыпродуценты могут стать прообразами принципиально новых биотерапевтических штаммов, полученных с использованием методов генетической инженерии. ДНК и пригодных для получения рекомбинантных пробиотических и биотерапевтических штаммов бифидобактерий. Разработанные в ходе данного исследования векторные системы уже в настоящее время используются для фундаментальных и прикладных исследований бактерий рода iii как в нашей стране, так и в ряде лабораторий США и Европы. Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава марта года, на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И. Мечникова в и годах, а также на международном симпозиуме iii iii i ii ii , . Криптические плазмиды, выделенные из кишечных штаммов бифидобактерий, могут быть использованы для создания челночных клонирующих векторов В1МоЬаег1ит Е. Гепетическитрансформироваипые штаммы бифидобактерий, полученные с использованием описанных челночных векторов, могут стать основой для создания принципиально нового поколения пробиотических и биогерапевтических агентов. По теме диссертации опубликовано печатных работ, в том числе 8 статей в рецензируемых научных журналах 5 в отечественных и 3 в зарубежных. Работа изложена на русском языке, на 0 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 9 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована рисунками и 4 таблицами.