Некультивируемые формы бактерий: выявление и изучение экспрессии генов с помощью количественного варианта полимеразной цепной реакции

• Автор: Аляпкина, Юлия Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
Содержание
Введение

Обзор литературы.

Глава 1. Некультивируемык формы патогенных бактерий и методы их

обнаружения

1.1. Общие сведения о некультивируемых формах бактерий.

1.2. Методы обнаружения НФ бактерий

1.2.1. Метод прямого подсчета жизнеспособных клеток

1.2.2. Метод прямого подсчета бактериальных клеток при использовании флуоресцентных красителей.
1.2.3. Методы, основанные на извлечении электронов из электроннотранспортной цепи жизнеспособных клеток
1.2.4. Метод иммунофлуоресценции.
1.2.5. Метод люминометрин
1.2.6. Метод проточной флуоресцентной цитометрии.
1.2.7. Молекулярногенетические методы.
1.3. Генетический контроль процесса перехода бактерий в НС.
Глава 2. Полимеразная цепная реакция.
2.1. Общие сведения о полимеразной цепной реакции
2.2. Теоретические основы количественного анализа
2.3. Синтез модифицированных праймеров олигонуклеотидов
2.3.1. Общие критерии выбора праймеров.
2.3.2. Твердофазный синтез олигонуклеотидов
2.3.3. Введение модификаций в олигонуклеотиды
2.4. Детекция и анализ ПЦРпродуктов.
2.4.1. Методы количественного определения продуктов конкурирующей ПЦР
2.4.2. Методы, основанные на иммобилизации ПЦРпродуктов на твердом носителе
2.4.3. Кинетический ГЩРанатиз, основанный на использовании флуорофоров
Собственные исследования.
Глава 3. Материалы и методы.
3.1. Культивирование микроорганизмов и их идентификация
3.1.1. Культивирование ii i.
3.1.2. Культивирование ii
3.1.3. Получение некультивируемых форм ii
3.2. Синтез праймеров
3.2.1. Выбор праймеров и зондов для ПЦРанализа
3.2.2. Синтез и очистка немодифицированных праймеров и зондов
3.2.3. Синтез и очистка модифицированных праймеров.
3.3. Проведение ПЦР
3.3.1. Реактивы для полимеразной цепной реакции
3.3.1. Выделение ДНК и подготовка проб для проведения ПЦР
3.3.2. Программы для проведения полимеразной цепной реакции
3.4. I вариант количественного анализа продуктов ПЦР.
3.4.1. Модификация поверхности микропланшега.
3.4.2. Иммобилизация олигонуклеотида на поверхности микропланшета
3.4.3. Выделение амплифицированного ПЦРфрагмснта из легкоплавкой агарозы.
3.4.4. Гибридизация амплифицированного фрагмента с зондом, иммобилизованным на поверхности микропланшета.
3.4.5. Колориметрическая детекция биотина реакция с коиьюгатом.
3.4.6. Построение калибровочных прямых и оценка результатов
3.5. И вариант количественного анализа продуктов ПЦР.
3.5.1. Реакцйя обратной транскрипции .
3.5.2. Покрытие поверхности микропланшета авидином.
3.5.3. Иммобилизация амплифицированного ПЦРфрагмента на поверхности микропланшета.
3.6.3. Проявление и измерение флуоресцентной метки.
3.6.4. Получение калибровочных прямых и оценка результатов.
Глава 4. Результаты и обсуждение
4.1. Структура и разработка количественных вариантов анализа продуктов ПЦР.
4.1.1. Введениеметки в амплифицируемый фрагмент 1 этап
4.1.2. Специфическое связывание амплифицированного фрагмента с целью отделения его от компонентов реакционной смеси 2 этап
4.1.3. Количественная детекция введенной метки 3 этап.
4.1.4. Сравнительная характеристика 1 и II вариантов количественного анализа
ПЦРпродуктов.
4.2. Применение I количественного варианта анализа ПЦРпродуктов для выявления НФ патогенных бактерий.
4.2.1. Изучение динамики численности ii i в объектах внешней среды.
4.2.2. Характеристики I количественного варианта анализа ПЦРпродуктов
4.3. Применение II варианта количественного анализа результатов ПЦР для оценки экспрессии генов ii в процессе перехода клеток в некультивируемое состояние.
4.3.1. Описание модели при изучении процесса перехода клеток ii в некультивируемое состояние
4.3.2. Разработка методического подхода к изучению экспрессии генов в НФ бактерий
4.3.3. Экспрессия генов в процессе перехода и пребывания ii
Выводы.
Литература


Впервые предложен методический подход на основе последовательных реакций обратной транскрипции и разработанного количественного варианта ПЦР для выявления и доказательства жизнеспособности бактерий в НС. РНК заведомо экспрессирующегося в НФ и известного исследователю гена. На модельном эксперименте с ii показано, что указанный метод можно рекомендовать для выявления жизнеспособных НФ различных бактерий в окружающей среде. Разработаны два варианта количественной анализа результатов полимеразной цепной реакции, основанные на иммобилизации ПЦРпродуктов на твердом носителе с последующим количественным определением иммобилизованного материала и включающие следующие этапы 1 введение молекулярной метки в амплифицированный фрагмент 2 специфическое связывание амплифицированного фрагмента с целью отделения его от компонентов реакционной смеси 3 количественную детекцию метки. Методы характеризуются разным решением этапов анализа и могут быть использованы для выявления бактерий в образцах различной природы, в том числе и в клинической диагностике. В данной работе методы применены для выявления НФ и количественной оценки числа бактерий ii i и ii в субстратах внешней среды. В сочетании с бактериологическим методом они позволяют дифференцировать НФ возбудителей и количественно оценивать их концентрацию в почвах и водоемах. По материалам диссертации опубликовано работ, результаты исследований были отмечены на конкурсе молодых ученых НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Работа доложена на VI конференции Российской Федерации Новые направления биотехнологии г. Пущино, г. Москва, г. Международном симпозиуме по Микробной Экологии Амстердам, г. X Интернациональном Конгрессе по Бактериологии и Прикладной Микробиологии Париж, г. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. В настоящее время стало общепризнанным, что патогенные бактерии способны существовать и активно размножаться не только в организме хозяина, но и в объектах внешней среды, а именно, в почве, в воде, на растительных субстратах, то есть вести сапрофитический образ существования Литвин . Более того, было установлено, что в ответ на резкие стрессовые условия окружающей среды бактерии способны переходить в состояние покоя, характеризующееся резко сниженной метаболической активностью и временной потерей способности к размножению. Подобное состояние покоя, обнаруженное у грамотрицательных бактерий в лаборатории в г. V Vi НС, а сами бактерии в таком состоянии некультивируемыми формами НФ . В настоящее время способность к переходу в НС показана для многих патогенных как для человека, так и для животных бактерий табл. Дебабов . Под термином некультивируемые формы, согласно и а, следует понимать такое состояние бактериальной клетки, при котором она не делится, но способна на более экономном уровне к ферментативной активности, фотосинтезу, дыханию, обмену энергией. Такие бактериальные клетки, утратив способность к размножению, не растут на обычных питательных средах, и поэтому их нельзя определить традиционым бактериологическим методом. Это состояние по ряду свойств напоминает состояние анабиоза у эукариотических клеток или споры бактерии и цисты простейших Романова . Факторы внешней среды, обуславливающие переход бактериальных клеток в НС, весьма многообразны. Наиболее изучены абиотические факторы температура, концентрация солей, свет, аэрация, содержание питательных веществ i , а, . В последнее время появились работы, посвященные воздействию биотических факторов на переход патогенных бактерий в покоящееся состояние. В I , I описано длительное существование холерных вибрионов с переходом в НС при взаимодействии с синезелеными водорослями. В серии экспериментов с иерсиниями ii i, ii i Пушкарсва , Сучков и листериями ii Пушкарева установлена способность зеленых водорослей и продуктов их метаболизма существенно влиять на сроки, темпы и полноту перехода патогенных бактерий в НС, причем это воздействие может иметь разную направленность в отношении отдельных видов бактерий. Процесс перехода бактерий из вегетативной в некультивируемую форму является обратимым.