Углеводные антигены и их вклад в строение клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum

• Автор: Матора, Лариса Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 266 с. : ил.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Ростстимулирующие ризобактерии р. АюзртИит модельный объект в исследованиях эффектов ассоциативности

1.2. Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий

1.2.1. Липополисахариды как мажорные компоненты наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

1.2.1.1. Структура и функции ЛПС.

1.2.1.2. Характеристика основных структурных элементов ЛПС

1.2.1.3. ЛПС как соматический антиген

1.2.1.4. Методы исследования иммунохимической специфичности ЛПС

1.2.1.5. Физикохимические свойства ЛПС

1.2.1.6. Изменения антигенных свойств ЛПС

1.2.1.7. Гетерогснность ЛПС
1.2.1.8. Изменения ЛПС при ЛБ диссоциации бактериальных культур
1.2.2. Капсульные полисахариды.
1.2.3. Бактериальный жгутик
1.2.3.1. Строение бактериальных жгутиков.
1.2.3.2. Жгутик как Нантиген
1.2.3.3. Гликозилирование полярного жгутика
1.2.3.4. Выявление чехла на поверхности полярного жгутика
1.3. Роль поверхностных структур микроорганизмов в растительномикробных взаимодействиях.
1.4. Роль углеводных компонентов наружной мембраны в процессах бактериальной агрегации.
1.5. Иммунохимические подходы в исследовании поверхности почвенных бактерий
1.5.1. Детектирование и идентификация бактерий в природной среде.
1.5.2. Серологические исследования диазотрофов
1.5.3. Перспективы серологического анализа азоспирилл.
1.6. Формулировка задач исследования
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Бактериальные штаммы, условия выращивания бактерий и использованные реактивы.
2.2. Иммунизация животных и получение антител.
2.2.1. Иммунизация животных целыми бактериальными клетками
2.2.2. Иммунизация животных изолированными препаратами ЭПС.
2.2.3. Иммунизация животных изолированным препаратом
2.2.4. Иммунизация животных мономерами флагеллина полярного жгутика.
2.2.5. Получение антител
2.3. Реакция агглютинации.
2.4. Препараты углеводных антигенов.
2.5. Получение препаратов полярного жгутика.
2.6. Изучение подвижности бактериальных клеток
2.7. Двойная иммунодиффузия.
2.8. Иммуноэлсктрофорез.
2.9. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг .
2 Дотанализ целых клеток и иммуноэлектронная микроскопия
2 Иммуноферментный анализ вариант I
2 Конкурентный иммуноанализ в оценке строения углеводных эпитопов бактерий.
2 Определение иммунохимичсской активности Оспецифичсского
полисахарида с применением метода спектротурбидиметрии.
2 Исследование агрегации клеток в супензиях
2 Исследование агглютинации эритроцитов и фазового разделения их суспензий под действием ЛПСсодержащих препаратов азоспирилл
2. Радиоиндикаторный анализ
Глава 3. Разработка способа получения моноспецифических антител на
Оантигены и модификация способа выделения высокоочищенных препаратов ЛПС.
3.1. Разработка способа получения моноспецифических антител на ЛПС.
3.1.1. Оценка эффективности иммунизации животных целыми бактериальными клетками, обработанными бифункциональным реагентом
3.1.2. Обсуждение возможного механизма ингибирования глутаровым альдегидом иммунного ответа на нативные белковые поверхностные антигены
3.2. Модификация способа получения высокоочищенных препаратов ЛПС
Глава 4. Иммунохимический анализ ЛПС модельных штаммов ii i
4.1. Анализ строения Оантигенных детерминант типового штамма
. i 7.
4.2. Исследование нетипичного характера диссоциации штамма
. i 7.
4.3. Исследование иммунохимической гетерогенности ЛПС азоспирилл.
4.3.1. Исследование иммунохимической гетерогенности Оспецифических полисахаридов штамма . i
4.3.2. Изменение антигенных свойств Оспецифичсских полисахаридов штамма Л. i 5 при модификации условий культивирования
4.3.3. Исследование иммунохимической гетерогенности Оспецифических полисахаридов штамма . i 7 и близкородственных штаммов
Глава 5. Сравнительный иммунохимический анализ ЛПС, капсульных
полисахаридов и экзополисахаридов ii i
Глава 6. Изучение Нантигенов ii i.
6.1. Выявление полисахаридного чехла на поверхности полярного жгутика
6.2. Исследование углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика.
6.3. Получение и анализ антител на флагеллин . i 7
6.4. Исследование изменений подвижности клеток азоспирилл при взаимодействии с антителами к О и Нантигенам.
Глава 7. Характеристика некоторых физикохимических свойств ЛПС
азоспирилл.
7.1. Сравнение спектрофотометрических характеристик ЛПС различных серотипов
7.2. Оценка структурообразующих эффектов бактериальных липополисахаридов в клеточных суспензиях азоспирилл и модельных клеточных суспензиях.
Глава 8. Тестсистема серологической идентификации бактерий
р. АгоэршИит
Заключение.
Выводы.
Список использованных источников


Липополисахариды представляют собой мажорные компоненты, присутствующие в составе наружных мембран практически всех грамотрицательных бактерий и являющиеся сильнейшими стимуляторами природного иммунитета у разнообразных эукариотических видов от насекомых до человека vi, x i, и даже у растений . Изучение этих важнейших бактериальных структур имеет более чем вековую историю и ведет отсчет с того момента, когда Рихард Пфайфер i i, сотрудник Роберта Коха, обнаружил, что лизаты прокипяченных бактерийвозбудителей холеры Vii вызывают у подопытных морских свинок реакцию токсического шока. Пфайфер установил, что данный термостабильный токсин локализован внутри бактериальной стенки погречески эндо, и вследствие этого назвал это соединение эндотоксином, что позволило четко отличать его от уже известного термолабильного экзотоксина, секретируемого данными бактериями i, i , . Примерно в то же время американский врач Вильям Коли ii В. Эти вакцины получили название токсинов Коли xi и обозначались так на протяжении трех последующих десятилетий , i , . Описанная вакцинная терапия часто приводила к полной ремиссии опухоли, однако зачастую вызывала у пациентов такие драматические побочные эффекты, как высокая температура и реакция токсического шока , . Такое же сочетание пирогенного и токсического эффектов, но сопровождающееся при этом стимуляцией общей иммунной устойчивости обнаружил немецкий ученый Ганс Бюхнер при применении бактериальных экстрактов к экспериментальным животным. У животных при этом наблюдалась повышенная температура, изменение индекса белых кровяных телец как лейкоцитоз, так и лейкопения, а также неспецифичсская устойчивость по отношению к бактериальным инфекциям i . В настоящее время известно, что биологические эффекты всех использованных бактериальных препаратов, в основном, были вызваны классом соединений, называемых липополисахаридами. Собственно термин липополисахарид был введен в г. Мюрреем Шеар . При попытке выделить фактор некроза опухолей из . К настоящему времени установлено, что липополисахарид является облигатным компонентом клеточной мембраны всех грамотрицательных бактерий и в значительной степени определяет их антигенные и поверхностные свойства , . Фракция ЛПС составляет около от массы внешней мембраны и заполняет примерно площади бактериальной поверхности V, . Интенсивное изучение этих структур началось после развития Вестфалем с сотрудниками . ЛПС, основанного на экстракции бактериальных клеток водным фенолом. Для определения получаемого биологически активного материала Вестфаль и Людеритц в своих работах использовали термин липопописахарид и сделали этот термин таким популярным ныне iii, . Другие термины, предложенные позже, такие как эндотоксический липосахарид i . Химические, серологические и биологические исследования группы ВестфаляЛюдсритца установили, что эндотоксин, пиротоксин, Оантиген и липополисахарид это один и тот же бактериальный компонент, и что как патогенные, так и непатогенные бактерии имеют на своей поверхности данные молекулы. К настоящему моменту известна только одна группа грамотрицательных бактерий, которая не экспрессирует ЛПС это различные виды рода i. Их наружная мембрана вместо ЛПС содержит гликосфинголипиды . Первым объектом детального исследования ЛПС стали энтеробактерии представители грамотрицательных бактерий, которые являются частью нормальной флоры кишечника или могут вызывать желудочнокишечные заболевания. Морфология колоний диких типов данных бактерий, относящихся к родам и ii, называется формой. Соответственно, их ЛПС стали обозначать как ЛПС дикого типа или ЛПС формы. К настоящему времени достаточно хорошо изучена структура ЛПС многих других семейств микроорганизмов, для которых показано строение ЛПС, не совсем характерное для энтеробактсрий . Тем не менее, рассмотрение принципа строения ЛПС обычно проводят на примере данной группы бактерий. На основании качественного, а, впоследствии, и количественного анализа моносахаридов разнообразных ЛПС формы приблизительно в году возникла концепция строения ЛПС.