Выделение и характеристика протеиназ поздней фазы роста Bacillus intermedius 3-19

• Автор: Соколова, Евгения Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Протсолитические ферменты микроорганизмов

1. Принципы классификации протеолитичсских ферментов

2. Сериновыс нротеииазы

3. Характеристика химотрипсииоподобпых протенназ

4. Глутамилэидоиептидазы новое подсемейство химотрипсииоподобпых протенназ микроорганизмов

4.1. Физикохимические свойства глутамилэндопептидаз

4.2. Аминокислотная последовательность и пространственная структура глутамилэндопептидаз
4.3. Роль аминокислот гистидиновой триады в первичной специфической активности глутамилэндопептидаз

4.4. Субстратная специфичность глутамилэндопептидаз

5. Характеристика субтнлизинов и субтилизнноподобных протенназ
5.1. Физикохимические свойства протенназ
5.2. Субстратная специфичность субтилизинов
5.3. Аминикислотная последовательность и пространственная структура ферментов
5.4. Строение активного центра и механизм действия субтилизинов
5.5. Стабильность субтилизинов
6. Эволюция сернновых протенназ
И. Функциональная роль протенназ бацилл
1. Множественность функций нротеолнтнческих ферментов
2. Локализация нротеолнтнческих ферментов в клетке
3. Связь секретируемых протеиназ бацилл и физиологии клетки
в стационарной фазе
III. Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Объект исследования и условии его культивирования
2. Определение белка и протеолитичсской активности
3. Определение активности Ргалактозидазы
4. Определение оптимальных концентраций основных компонентов питательной среды в двухфакторных
экспериментах
5. Выделение и очистка глутамилэндоиентндазы и
субтилизиионодобной протеи низы
6. Фнзнкохнмическне и кинетические свойства ферментов
7. Энзиматические свойства глутамнлэидопептидазы и субтилизиионодобной протеииазы на поздних стадиях роста
8. Математическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
I. Подбор состава питательной среды для максимальной
продукции глутамнлэидопептидазы 2 и субтилизиионодобной протеииазы 2 НасШт
1.1. Исследование динамики роста культуры, биосинтеза ферментов и их локализации
1.2 Влияние концентрации пептона и неорганического фосфата на биосинтез ферментов В. ii 3 поздней стационарной фазы
1.3. Влияние источников углерода на биосинтез ферментов поздней стационарной фазы роста культуры
1.4. Влияние аминокислот, белковых субстратов и других факторов
на биосинтез протеолитических ферментов
1.5. Влияние ионов двухвалентных металлов на биосинтез протеиназ
В. ii поздней стадии роста
II. Выделение, очистка и характеристика протеиназ В. ii поздней стадии роста
2. 1. Получение гомогенных препаратов протеиназ из культуральной жидкости В. ii
2.2. Физикохимические свойства протеиназ поздней стационарной фазы роста В. ii
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
I. Биосинтез
П. Выделение ферментов i ii поздней фазы роста и определение их свойств
ВЫВОДЫ
Благодарности
ЛИТЕРАТУРА


Связь работы с научнимы программами и собственный вклад автора в исследования Научные исследования поддержаны грантами РФФИ 7, 2а, АНТ . Программы 7. В. ii 3. Ферменты ранней и поздней фазы роста В. Михаэлиса и каталитической константе. Идентичные аминокислотные последовательности концов глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы ранней и поздней фаз роста В. В. ii 3. Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и региональных конференциях 9й Международной Путинской школеконференции молодых ученых Пущино, г. Казанского Государственного Университета г. Биохимического общества СанктПетербург, , а также на семинарах кафедры микробиологии и Института Биологии Казанского Государственного Университета. Публикации По теме диссертации опубликовано научных работ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 0 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц, рисунка. Библиография содержит 7 наименований российских и зарубежных авторов. Протсолитические ферменты, гидролизующие пептидные связи, относятся к подклассу пептидгидролаз протеаз 3. Дальнейшая классификация протеаз основывается на двух важных, но совершенно разных критериях на специфичности гидролизуемой пептидной связи и структуре активного сайта. На основе первого критерия специфичности расщепляемой связи пептидгидролазы подразделяются на пептидазы экзопептидазы 3. На основе второго критерия строения активного сайта эндопротеиназы подразделяются на четыре группы сериновые 3. Сериновые протеиназы содержат в активном центре аминокислотные остатки гистидина, аспарагина и серина и обладают специфическим способом белкового фолдинга i , . Ферменты этой группы чувствительны к химическим реагентом на остатки серина и . Сериновые протеиназы обычно имеют оптимум действия в районе 7,5 , температурный оптимум С. Зрелая форма ферментов этой группы содержат до остатков, концевая каталитическая часть молекулы содержит до 1 остатков, а сигнальные или активационные пептиды до 0 остатков. Некоторым белкам этой группы, например, субтилизинам, присущи вариабельные Сконцевые структуры дополнительные витки цепи, богатые участки, трансмембранные сегменты. Цистеиповые протеипазы содержат в активном центре цистеин. Ферменты цистеиновой группы ингибируются тяжелыми металлами и йодацетамидом за счет взаимодействия этих реагентов с сульфгидрильными группами активного центра. Оптимальными условиями для функционирования этих белков является слабощелочная и кислая среда. Первоначально эти протеиназы были выделены из клеток грибов и высших эукариот. Аспартатпые протеипазы широко распространены. Подобные белки были обнаружены у микроорганизмов аспергиллопептидаза, животных пепсин, ренин, вирусов протеаза ВИЧ1. Ранее считалось, что ферменты этой группы функционируют только при значениях близких к 1, но сейчас описано несколько аспартатных протеиназ, оптимум которых близок к нейтральным значениям ренин, НЛР, протеаза ВИЧ1 и др Подобная вариабельность рНоптимумов может объясняться особенностями структуры белковой молекулы. Молекулы формируются двумя доменами, совершенно разными по аминокислотной последовательности, но топологически эквивалентными по пространственной структуре. Молекулы протеиназ ретровирусов и ретротранспозонов состоят из двух одинаковых мономеров, похожих по структуре на домены пепсина Печик с соавт. Активный сайт и зона связывания субстрата аспартатных протеиназ формируется в центральной части молекулы во впадине между мономерами доменами и содержат два аспарагиновых остатка, серии и молекулы воды, принципиально важные для катализа v, , . Металлопротеазы встречаются как у животных и растений, так и у микроорганизмов. Свое название группа получила изза наличия ионов металлов в молекулах ферментов. Чаще всего металлопротеазы содержат в активном центре ионы цинка, марганца, реже кобальта и магния.