Генетические мутации микобактерии туберкулеза, ответственные за резистентность к рифампицину у больных туберкулезом: идентификация и характеристика

• Автор: Исаева, Елена Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с.

Оглавление

Список сокращений.

Введение

Часть 1 .Обзор литературы

Глава 1 .Молекулярные механизмы устойчивости i i к рифампицину

Глава 2.Лабораторные методы диагностики чувствительности i i к противотуберкулезным препаратам.

2.1. Фенотипические методы диагностики

2.1.1 .Определение чувствительности i

i к противотуберкулезным препаратам на плотных средах.

2.2.1.Определение чувствительности i

i к противотуберкулезным препаратам на жидких средах

2.3.1. Ванализ
2.2.Генотипические методы диагностики.
Часть И. Собственные исследования
Глава 3. Материал и методы.
3.1 .Обследованные пациенты.
3.2.Клинические культуры i i
3.3.Определение лекарственной чувствительности к рифампицину
3.4.0бработка клинического материала
3.4.1 .Забор материала
3.5.Обработка биологических проб
З.б.Выделение ДНК из клинического материала.
3.6.1.Выделение ДНК для проведения ПЦР на i i.
3.6.2.Выделсние ДНК для НестедПЦР
3.7.Выявление ДНК i i в клиническом материале.
3.7.1 .Реакция амплификации.
3.7.2.Регистрация и анализ продуктов амплификации
3.7.3 .Анализ результатов.
3.8.Выявление гена гро В
3.8.1.Получение универсального гетеродуплексного гене ратора
3.8.2. ХеминестедПЦР туберкулезных образцов
3.8.3. Гибридизация.
3.8.4.Вертикальный электрофорез.
3.8.5.Анализ результатов
3.9.Прямое секвенирование ПЦРфрагментов
3Стандартные характеристики системы.
Г лава 4. Адаптация метода ПЦРгетеродуплексного анализа
4.1 .Первичная обработка биологического материала
4.2.Лизис клеточной стенки с выделением ДНК.
4.3.ХеминестедПЦР .
4.4.0пределение чувствительности метода ПЦР гетеродуплексного анализа.
4.5.Определение специфичности метода ПЦР
гетеродуплексного анализа
Глава 5.Сравнение эффективности выявления чувствительных и резистентных к рифампицину штаммов
i i методом ПЦРгетеродуплексного анализа и культуральными методами в клинических изолятах и образцах.
5.1.Сравнение эффективности выявления чувствительных и резистентных к рифампицину штаммов
i i в клинических изолятах
5.2.Сравнение эффективности выявления чувствительных и резистентных к рифампицину штаммов
i i в клинических образцах
Глава б.Характеристика резистентных к рифампицину мутаций, выявленных методом ПЦРгетеродуплексного анализа.
Заключение
Выводы
Библиография


Показатель заболеваемости туберкулезом населения число больных с впервые в жизни установленным диагнозом на 0 тыс. Москве, составил в году ,4 , в том числе подростков ,7, детей 7,9 Литвинов В. И. и др. В Российской Федерации в году показатель заболеваемости туберкулезом составил ,7 Шилова М. В., . Особое значение приобрел туберкулез в связи с ростом заболеваемости синдромом приобретенного иммунодефицита. Риск заболеть туберкулезом в 0 раз больше для больных СПИДом, в 3 для ВИЧинфицированных, в 3,6 раз изза других иммунодефицитных заболеваний, чем для людей, не входящих в эти группы риска . Одной из основных причин увеличения заболеваемости туберкулезом является возрастание числа лиц, инфицированных i i, устойчивыми к какомулибо противотуберкулезному препарату или обладающими множественной лекарственной устойчивостью. К последним относятся i i, нечувствительные по меньшей мере к двум основным противотуберкулезным препаратам изониазиду и рифампицину I М. . i . i . Vi . v . . и соавт. По данным М. Мооге и соавт. США имеют устойчивость хотя бы к одному из основных препаратов первого ряда изониазиду и рифампицину, а в 23 случаях имеет место множественная лекарственная устойчивость. По данным ВОЗ в мире по крайней мере млн людей инфицировано устойчивыми к лекарственным препаратам штаммами i i ВОЗ, . Одними из главных причин распространения полирезистентного туберкулеза являются его поздняя диагностика и неправильное или незавершенное лечение, следовательно, как можно более раннее выявление возбудителя и определение его чувствительности к противотуберкулезным препаратам имеет принципиальное значение для назначения больному своевременного и адекватного лечения. Одним из основных химиопрепаратов при лечении туберкулеза в настоящее время является рифампицин. Механизм его действия на i i и причины, вызывающие устойчивость к нему, достаточно изучены на молекулярногенетическом уровне. Показано, что более случаев резистентности к рифампицину у больных туберкулезом обусловлено мутациями в коротком фрагменте н. В, кодирующего РНКполимеразы i i i . V. На данный период времени известно более мутаций в этом участке гена, ответственных за резистентность к рифампицину. Раннее выявление рифампицинрезистентных мутаций имеет важнейшее практическое значение, так как позволяет в значительном числе случаев осуществить своевременную коррекцию лечения. Нельзя не отметить, что резистентность к рифампицину является своеобразным маркером множественной лекарственной устойчивости i i i . i i в США по данным . и соавт. Как правило, резистентные к рифампицину штаммы i i устойчивы и к другим противотуберкулезным препаратам. Существует несколько методов выявления мутаций гена гроВ i i секвенирование, конформационный полиморфизм однонитевых ДНК, дидезоксифингерпринтинг и др. Особенно важно значение методов, которые можно применять в клиниколабораторной диагностике. Нами для этой цели был использован метод ПЦРгетеродуплексного анализа, так как он методически достаточно прост, относительно не дорог, его выполнение занимает около 6 часов и полученные данные легко интерпретировать. Цель настоящей работы идентификация и анализ аллельных вариантов гена гроВ, ответственных за устойчивость к рифампицину, среди клинических изолятов и образцов i i, полученных от больных туберкулезом. Адаптировать гетеродуплексный анализ для выявления резистентных к рифампицину штаммов i i в клинических изолятах и образцах, полученных от больных туберкулезом. Сравнить возможности молекулярного гетеродуплексный анализ и культуральных рост на плотных и жидких средах методов по выявлению резистентных к рифампицину штаммов i i в клинических изолятах и образцах.