Использование нового метода ПЦР-фингерпринтинга для дифференциации микроорганизмов на низших таксономических уровнях

• Автор: Цыганкова, Светлана Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 173 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Методы идентификации микроорганизмов

1.1. Идентификация микроорганизмов, основанная на фенотипических методах

1.2. Идентификация микроорганизмов, основанная на генотипических методах

1.2.1. Определение ГЦ состава молекул ДНК.

1.2.2. ДНКДНК и ДНКРНК гибридизация.

1.2.3. Секвенирование белков и нуклеиновых кислот.

1.2.4. Использование ДНКзондов для обнаружения бактерий и изучения состава микробных популяций

1.2.5. Краткая характеристика бактериального генома.

1.2.6. Использование ПЦР со специфичными праймерами для обнаружения и идентификации бактерий.
1.2.7. ДНКфингерпринтинг.
ГЛАВА 2. Характеристика отдельных групп бактерий
2.1 Фитопатогенные бактерии родаX.
2.1.2. Генетические взаимоотношения внутри вида i.
2.2. Бактерии группы i
2.2.1. Энтомопатогснныс бактерии вида i iii
2.2.2. Методы идентификации и классификации бактерий вида i iii
2.2.3. Методы, используемые для идентификации генов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования.
3.1. Объекты исследования.
3.2. Выделение препаратов ДНК из биомассы.
3.3. ПЦР со специфическими праймерами к , сгуЗ и сгу4 генам.
3.4. ПЦР с и праймерами
3.5. ПЦР с использованием праймеров к различным повторяющимся элементам
3.6. Очистка фрагментов ПЦР в агарозе.
3.7. Филогенетический анализ
3.8. Клонирование ПЦРфрагментов
3.8.1. Приготовление компетентных клеток
3.8.2. Лигирование.
3.8.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК 3.8.4. Выделение плазмидной ДНК
3 8 Рестрикционный анализ плазмидной ДНК
3.9. Секвениронание плазмид со вставкой
3.9.1. Мечение праймеров
3 9.2. Постановка реакции секвснирования
3 ПЦР анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 4. Подбор олигонуклеотидных праймеров для проведения IПЦР
ГЛАВА 5. Оптимизация условий проведения IПЦР
5.1. Оптимизация условий IПЦР для бактерий родов X и i
ГЛАВА 6. Изучение генетических взаимоотношений между изолятами X
i v. i
6.1. Сиквенсный анализ нуклеотидных последовательностей рРНК и мсжгенной
области рРНК. .
6.2. Получение видо и штаммоспецифичных фингерпринтов на ДНК X,
выделенных в различных географических ареалах
6.3. Фонетический анализ полученных геномных фингерпринтов
6.4. Сравнение эффективности IПЦР и ПЦР при изучении генетического
полиморфизма штаммов X
6.5. Разработка и тестирование праймеров для X i
ГЛАВА 7. Изучение внутривидового разнообразия энтомопатогенных бактерий вида
i iii .
7.1 ПЦРанализ с использованием праймеров, специфичных к 3 и
4 генам
7.2. Секвенирование и рестрикционный анализ ПЦРфрагментов,
соответствующих генам
7.3. Сиквенсный анализ 5концевых областей и рРНК и межгенной области
рРНК
7.4. Изучение энтомопатогенных штаммов В. iii методом IПЦР
7.5. ПЦРанализ энтомопатогенных штаммов В. iii с применением праймерных систем к мобильным элементам, межгенным повторам и к терминаторным последовательностям
7.6. Фенетический анализ ПЦРфингерпринтов энтомопатогенных бактерий вида В. iii
7.7. Разработка и тестирование праймеров для В. iii, патогенных в
отношении насекомых отряда i.
ГЛАВА 8. Выявление геномных различий диссоциантов штаммов i и
i ii.
8.1. Проверка видовой чистоты диссоциантов В.
8.1.1. Сиквенсный анализ 5вариабельной области гена рРНК.
8.1.2. Проверка диссоциантов В. на наличие генов
8.2. ПЦРанализ диссоциантов В. с использованием праймеров к мобильным элементам
8.3. Фенетический анализ ПЦРфингерпринтов диссоциантов
В. и В. ii.
ГЛАВА 9. Анализ таксономической надежности и разрешающей способности IПЦР в сравнении с другими методами ДНКфингерпринтинга на примере видов i iii и X i
9.1. Анализ штаммов рода X
9.2. Анализ штаммов вида i iii.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Однако данные подходы имеют некоторые технические ограничения для анализа требуется большое количество ДНК результаты, получаемые при помощи разных модифицированных методик, часто не совпадают крайне сложно одновременно проанализировать большое количество образцов. Секвенирование белков и нуклеиновых кислот. С усовершенствованием молекулярнобиологических технологий появилась возможность определять последовательности биополимеров белков и нуклеиновых кислот. Это дало возможность сравнивать не только гены или их отдельные участки, но и в некоторых случаях полные геномы бактерий. Данные методы стали использовать в филогенетических исследованиях, при идентификации бактерий и при изучении природных сообществ. Исторически первым объектом для секвенирования стали белки. Изучение структурнофункциональных особенностей различных типов белков ферредоксинов позволило сделать заключения об эволюционной взаимосвязи между хлоропластами водорослей, высших растений и цианобактериями, а также между фототрофными и аэробными нсфототрофными бактериями. В эволюционном аспекте исследовалась также структура пластоцианинов. Результаты свидетельствовали о тесной эволюционной связи цианобактерий и фототрофных эукариот или их хлоропластов Турова, . Еще одной молекулой, которая интенсивно использовалась для филогенетических исследований стал цитохром с. Однако, сравнение цитохромов сг системы фотосинтеза пурпурных фототрофных бактерий и дыхательных цитохромов С0 аэробных бактерий указывало на тесное филогенетическое родство этих микроорганизмов, что противоречило традиционным представлениям Булыгина, . Так что, использование белков в качестве молекулярных хронометров ограничено. Это объясняется тем, что для исследований необходимы молекулы, функционально постоянные среди различных групп бактерий. Но ни один из используемых классов белков не имеет универсального распространения среди прокариот и эукариот, а объединение данных по аминокислотным последовательностям различных классов белков может привести к ошибочным заключениям Турова, . Поэтому в дальнейшем для филогенетических исследований стали использовать рибосомные РНК. Они универсально распространены, являются функционально постоянными молекулами, достаточно консервативны для того, чтобы установить дальние эволюционные взаимосвязи и, кроме того, рРНК достаточно просто выделять для исследования. Одной из первых рибосомных РНК, которую использовали для изучения эволюционных отношений между микроорганизмами и для их идентификации, стала 5 рРНК. На основе сравнения нуклеотидных последовательностей этой небольшой молекулы 0 нуклеотидов проводились исследования эволюционных взаимоотношений среди таких больших групп организмов как зеленые растения и грибы, а также среди многочисленных групп микроорганизмов Булыгина, . Кроме того, с его помощью изучали состав микробных популяций , . Данный метод позволял исследовать небольшие микробные сообщества, включающие не более полутора десятков бактерий. Однако, он не нашл широкого распространения изза малой информативности этой молекулы при е относительно высоком консерватизме. Другой метод идентификации микроорганизмов, получивший в настоящее время наиболее широкое распространение, основан на сравнении нуклеотидных последовательностей рРНК. Ген рРНК имеет ряд преимуществ по сравнению с 5 рРНК его длина составляет примерно нуклеотидов, он состоит как из консервативных, так и вариабельных доменов и присутствует в клетках всех прокариотических микроорганизмов. Кроме того, по решению Международного Комитета по Систематике микроорганизмов, нуклеотидная последовательность рРНК должна быть определена для всех вновь описываемых видов бактерий, поэтому база данных для этой молекулы достаточно обширна и постоянно пополняется , . Анализ нуклеотидных последовательностей рРНК позволяет с высокой степенью достоверности определять как филогенетическое положение микроорганизмов, так и наджно идентифицировать их на родовом, а иногда и на видовом уровнях. Причем, для проведения идентификации достаточно определить нуклеотидов 5концсвой области, что значительно ускоряет такой анализ.