Получение и характеристика рекомбинантных доменов белка LigA как компонентов потенциальной субъединичной противолептоспирозной вакцины

• Автор: Шарапова, Наталья Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 154 с. : ил.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Краткая характеристи ка i i

1.1.1. Классификация и таксономия лептоспир

1.1.2. Морфология, культуральные и биохимические свойства.

1.1.3. Молекулярногенетические особенности лептоспир.

1.1.3.1. Анализ секвенированных геномов лептоспир.

1.1.3.2. Основные факторы патогенности и антигенные детерминанты лептоспир.

1.2. Иммунопрофилактика лептоспирозов

1.2. Г. Традиционные нротиволептоспирозные вакцины.

1.2.2. Разрабатываемые вакцины для профилактики лептоспирозов .

1.3. Проблемы получения основных компонентов для разработки генноинженерных субъединичных вакцин антигенов и возможные пути их решения.
1.3.1. Проблемы гетерологичной экспрессии, выделения и очистки белков. Аффинные домены в технологии создания химерных белков
1.3.2.Проблема формулирования инъекционных препаратов и повышения их иммуногенности. Использование аффинной иммобилизации антигенов на полисахаридных сорбентах.
1.3.2.1. Использование 1,3Рглюкана в качестве иммуносорбента
1.3.2.2. Способы получения препарата частиц глюкана из дрожжей
и его свойства
1.3.2.3 Глюкансвязывающие модули и их применение в качестве аффинных доменов
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Материалы
2.1.1. Бактериальные штаммы.
2.1.2. Плазмидные векторы.
2.1.3. Олигонуклеотиды
2.1.4. Ферменты.
.5. Сыворотки.
2.1.6. Лабораторные животные
2.1.7. Растворы.
2.1.8. Антибиотики
2.1.9. Питательные среды.V. V
2.1. Иммуномакс
2.1 Лабораторное оборудование.
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование лептоспир.
2.2.2. Определение концентрации лептоспир в счетной камере ПетроваХауссера.
2.2.3. Выделение хромосомной ДНК лептоспир.
2.2.4. Выделение и очистка аналитических количеств плазмидной ДНК
2.2.5. Выделение и очистка препаративных количеств плазмидной ДНК.
2.2.6. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами
2.2.7. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.
2.2.8. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля
2.2.9. Лигирование фрагментов ДНК
2.2 Трансформация клеток, i
2 Приготовление компетентных клеток
2 Электропорация.
2.2 Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.2 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.2 Фракционирование белков методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях
ПААГДСН и иммуноблоттинг
2.2 Выращивание штаммапродуцента Я. i и индукция синтеза рекомбинантных белков.
2.2 Анализ физикохимического состояния рекомбинантных белков
2.2 Выделение и очистка химерных белков, содержащих целлюлозосвязывающий или 1,3рглюкансвязывающий домен, методом аффинной иммобилизации на полисахаридных сорбентах
2.2 Постановка непрямого иммуноферментного анализа.
2.2 Иммунизация лабораторных животных
2 Иммунизация кроликов.
2 Иммунизация крыс.
2.2 Взятие крови и приготовление сывороток.
2.2 Определение концентраций цитокинов в сыворотках крыс
2.2 Приготовление препарата частиц глюкана.
Глава 3. Результаты исследований.
3.1. Получение бактериальных штаммовпродуцентов рекомбинантных иммуноглобулиноподобных доменов белка i i i
3.1.1. Создание экспрессионных конструкций, кодирующих отдельные иммуноглобулиноподобные домены белка i
3.1.1.1. Получение ПЦРфрагментов гена i, кодирующих иммуноглобулиноподобные домены
3.1.1.2. Клонирование ПЦРфрагментов с помощью векторов 6 и
3.1.1.3. Создание штаммовпродуцентов рекомбинантных доменов i
3.1.2. Создание бактериальных штаммовпродуцентов химерных белков, состоящих из рекомбинантных иммуноглобулиноподобных доменов белка i и целлюлозосвязывающего домена .
3.1.2.1. Создание экспрессионных конструкций, содержащих минигены рекомбинантных доменов белка i с целлюлозосвязывающим доменом .
3.1.2.2. Создание штаммовпродуцентов химерных белков , 4, 5, содержащих рекомбинантный иммуноглобулиноподобный домен i с целлюлозосвязывающим доменом.
3.2. Создание бактериальных штаммовпродуцентов химерных белков, состоящих из рекомбинантных иммуноглобулиноподобных доменов
белка i и 1,3Рглюкансвязывающего домена
3.2.1. Создание экспрессионной конструкции, кодирующей рекомбинантный 1,3Рглюкансвязывающий домен ii i
3.2.1.1. Клонирование фрагмента гена i, кодирующего 1,3Рглкжансвязывающий домен .
3.2.1.2. Получение экспрессионной конструкции, кодирующей рекомбинантный 1,3Рглюкансвязывающий домен и глицинсериновый спейсер.
3.2.2. Создание экспрессионных конструкций, кодирующих химерные белки , 4, 5, содержащие рекомбинантный иммуноглобулиноподобный домен белка i и 1,3Рглюкансвязывающий домен .
3.2.3. Создание штаммовпродуцентов химерных белков , 4, 5, содержащих рекомбинантный иммуноглобулиноподобный домен i с 1,3Рглюкансвязывающим доменом.
3.3. Выделение и очистка химерных белков с использованием полисахаридных сорбентов
3.3.1. Выделение и очистка белка 5 методом аффинной иммобилизации на аморфной целлюлозе.
3.3.2. Выделение и очистка белка 5 методом аффинной иммобилизации на 1,3Рглюкане
3.4. Изучение антигенных и иммуногенных свойств полученных препаратов.
3.4.1. Анализ антигенных свойств рекомбинантных белков с набором сывороток больных лептоспирозом людей.
3.4.1.1. Исследование антигенной структуры полученных рекомбинантных белков методом иммуноблоттинга с сыворотками больных.
3.4.1.2. Изучение антигенной специфичности рекомбинантного антигена СЕЮ. Определение титров 1Аспецифических антител в сыворотках больных с использованием рекомбинантных антигенов
3.4.2. Исследование антигенных и имуногенных свойств белков СЬЮ, ОЕЮ. Получение кроличьих антисывороток к рекомбинантным антигенам СВЭ, С1Ш и комплексам СВОцеллюлоза и ОВОглюкан
3.4.2.1. Иммунизация кроликов рекомбинантными антигенами СВ
и И5ОВО и комплексами СВОцеллюлоза и 0В0глюкан
3.4.2.2. Определение титров специфических антител в полученных кроличьих сыворотках.
3.4.3. Сравнительное исследование иммуногенных свойств препаратов в эксперименте на крысах
3.4.3.1. Исследование сывороточных цитокинов крыс, синтезируемых при иммунизации разработанными препаратами
3.4.3.1. Определение титров специфических антител в сыворотках иммунизированных крыс.
Глава 4. Обсуждение результатов.
Выводы
Благодарности.
Список использованной литературы


Впервые исследованы антигенные свойства рекомбинантных автономных иммуноглобулиноподобных доменов и подтверждено сохранение их антигенной конформации. Кроме того, обнаружена групповая специфичность этих антигенов при исследовании с сыворотками больных лептоспирозами. Проведено оригинальное сравнительное исследование иммуногенных свойств химерных белков, иммобилизованных на аморфной целлюлозе и частицах 1,3Рглюкана, в сравнении с иммунизацией живой культурой и инактивированной противолептоспирозной вакциной. Научнопрактическая значимость работы. Предложенный подход, позволяющий получать иммуногенные композиции на основе рекомбинантных антигенов лептоспир и углеводных сорбентов, может быть использован для разработки аналогичных препаратов, содержащие рекомбинантные антигены других микроорганизмов. Также проведены сравнительные исследования антигенных и иммуногенных свойств полученных бслковополисахаридных комплексов и индивидуальных антигенов. Полученные охарактеризованные препараты рекомбинантных антигенов лептоспир могут быть использованы при разработке новых субъединичных кандидагных препаратов для профилактики лептоспироза, а также при создании новых диагностических тестсистем на основе ИФА. На созданные в данной работе рекомбинантные плазмиды и антигены, штаммыпродуценты рекомбинантных белков, а также способ их выделения и очистки оформлены 3 заявки на получение патента. Апробация работы. Результаты работы доложены на третьей международной конференции Фундаментальные науки медицине в г. Новосибирске сентября г, на Международном междисциплинарном симпозиуме От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине в г. Судак Крым, Украина сентября г. Нанотехнологии в медицине 3е место в рамках Международного форума по нанотехнологиям в г. Москве декабря г. Общества биотехнологов России в г. Пущиио октября г. Окружающая среда и здоровье в г. Рязани мая 1 июня г. Н.Ф. Гамалеи РАМН в рамках научного доклада апреля г. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии в ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН 4 апреля г. Апробация диссертации состоялась февраля г. НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ. По результатам работы оформлены 3 заявки на получение патента. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 4 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы, содержащий ссылки на отечественных и 9 иностранных источников. Работа иллюстрирована таблицами и рисунками. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В представленном обзоре литературы приведена краткая характеристика лептоспирозов, описаны основные морфологические и культуральные свойства возбудителя лептоспирозов . В следующем разделе основное внимание уделено описанию применяемых в настоящее время противолсптоспирозных вакцин, их преимуществ и недостатков, а также сравнению свойств разрабатываемых перспективных вакцинных препаратов. В последнем разделе литературного обзора подробно рассматриваются методологические проблемы, возникающие при получении препаратов рекомбинантных антигенов, и описаны возможные пути их решения. Лептоспироз синонимы болезнь ВасильеваВайля, инфекционная желтуха, нанукаями, японская 7дневная лихорадка, водная лихорадка, луговая лихорадка, собачья лихорадка и др. Классификация и таксономия лептоспир. Филогенетический анализ показал, что лептоспиры по структурной организации близки к другим спирохетам 3. Кластер лептоспир четко подразделяется на две подгруппы первая включает непатогенные сапрофитные лептоспиры i ix и патогенные . Вторая подгруппа представлена одним штаммом iii род близким по фенотипу сапрофитам. Средний уровень гомологии РНК штаммов первой и второй группы составил ,2. Результаты этих исследований явились научным обоснованием для решения Международного комитета по таксономии лептоспир о повышении ранга.