Разработка молекулярных методов выявления в воде и клинических образцах вирусов - этиологических агентов заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи

• Автор: Оксанич, Алексей Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая характеристика клинически значимых кишечных

вирусов

1.1.1. Общая характеристика семейства Р1сотаутс1ае

1.1.2. Эпидемиология и клиника заболеваний, вызываемых кишечными вирусами семейства Ркюгпау1п1ас

1.1.2.1. Полиовирусы.

1.1.2.2. Вирусы Коксаки, ЕСНО и Энтеровирусы .

1.1.2.3. Парэховирусы

1.1.2.4. Вирус гепатита А
1.1.3. Устойчивость энтеровирусов к воздействию физических .
и химических факторов
1.1.4. Общая характеристика семейства Абепоушбае
1.1.5. Ротавирусы, астровирусы, коронавирусы и калицивирусы.
1.2. Методы выявления кишечных вирусов в воде.
1.2.1. Методы концентрирования вирусов из воды
1.2.2. Диоксид кремния. Принципы адсорбции белков и
вирусов на силикагелях.
1.2.3. Методы выявления кишечных вирусов
1.2.4. Молекулярные методы исследования.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы
2.1.1. Культуральные штаммы вирусов.
2.1.2. Клинические образцы и образцы сточных вод
2.1.3. Клеточные линии
2.1.4. Реактивы .
2.2. Методы.
2.2.1. Молекулярнобиологические методы.
2.2.2. Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных вирусов из воды.
2.2.3. Концентрирование кишечных вирусов из воды
2.2.4. Пробоподготовка
2.2.4.1. Приготовление фекальных суспензий.
2.2.4.2. Выделение вирусных нуклеиновых кислот из биологического материала
2.2.5. Реакция обратной транскрипции ОТ.
2.2.6. Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной
детекцией в режиме реального времени ТацМап
2.2.7. Количественная ПДРРВ
2.2.7.1. Приготовление калибраторов
Построение калибровочных прямых.
2.2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.9. Метод трансмиссивной электронной микроскопии.
2.2 Методы выявления и идентификации кишечных вирусов.
2.2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.2 Статистическая обработка результатов исследований.
Глава 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ
ВИРУСОВ ИЗ ВОДЫ.
3.1. Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных
вирусов из воды
3.2. Определение емкости сорбента ММ при концентрировании
белков и выделении нуклеиновых кислот
3.3. Концентрирование кишечных вирусов из воды на сорбентах
ММ и ММт.
Глава 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦРРВ С ВПК ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК И РНК
КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ.
4.1. Подбор праймеров и зондов.
4.2. Оценка специфичности праймеров и зондов с
использованием лабораторных штаммов вирусов
4.3. Оптимизация условий ОТ и ПЦР
4.4. Оценка чувствительности мультиплексной ПЦРРВ
4.5. Разработка методов количественной оценки ДНК
и РНК кишечных вирусов
Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ И
ОБРАЗЦОВ СТОЧНЫХ ВОД МЕТОДОМ ПЦРРВ
5.1. Анализ клинических образцов методом ПЦРРВ.
5.2. Анализ сточных вод методом ИКМПЦРРВ
5.3. Анализ образцов сточных вод методом ПЦРРВ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В то же время часто регистрировались вспышки г инфекционных кишечных заболеваний с неясной этиологией. Затруднения при определении возбудителей этих заболеваний отчасти связаны. Наиболее, сложным и несовершенным этапом вирусологического контроля воды является процесс концентрирования вирусов. В настоящее время в распоряжении санитарных вирусологов имеется ряд методов концентрирования вирусов из воды Г, 6, которые нуждаются в оптимизации, в. Значимость кишечных вирусов в инфекционной патологии человека определяет необходимость их своевременного выявления. До настоящего времени золотым стандартом лабораторной диагностики энтеровирусной и аденовирусной инфекции и выявления энтеровирусов в окружающей среде остается реакция нейтрализации с типоспецифическими сыворотками в культуре чувствительных клеток. ИФ, характеризующиеся меньшими затратами времени по сравнению с . Сложность, длительность и трудоемкость обусловлена различной чувствительностью клеточных культур к отдельным представителям рода vi и множеством их антигенных вариантов. По этой причине затруднена и разработка унифицированных диагностикумов, позволяющих быстро и эффективно проводить выявление и дифференциацию энтеровирусов. Кроме того, ряд кишечных вирусов например, калицивирусы и вирус гепатита А с трудом поддаются культивированию. Решение данной проблемы в последние годы связывают с развитием молекулярнобиологических лабораторных методов, таких как ПЦР с гибридизационной идентификацией продуктов амплификации мультиплексная ПЦР, а также ПЦР в режиме реального времени 3, , ,. Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования была разработка методов концентрирования энтсровирусов ЭВ, аденовирусов АВ и вируса гепатита А ВГА из воды, а также их выявления в сточных водах и фекальных суспензиях методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Синтезировать несколько вариантов сорбентов для концентрирования вирусов из воды. Отработать методы количественного учета ДНК и РНК вирусов для оценки эффективности концентрирования вирусов из воды. В модельных экспериментах оценить эффективность концентрирования вирусов из воды с применением синтезированных сорбентов. Подобрать праймеры и зонды для ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ПЦРРВ для выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А в мультиплексном формате и тестировать их на лабораторных штаммах вирусов. Провести сравнительный анализ клинических образцов от пациентов с ОКИ методами мультиплексной ПЦРРВ и культуры клеток. Проанализировать образцы элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из образцов сточных вод, на. АВ, ЭВ и ВГА методами мультиплексной ПЦРРВ и ПЦР интегрированной с культуральным методом. Научная новизна работы. Впервые показана возможность с высокой эффективностью концентрировать кишечные вирусы из воды с использованием магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния. Впервые в России разработан метод для одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А с использованием внутреннего положительного контроля, основанный на мультиплексной ПЦР с флуоресцентнойдетекцией в режиме реального времени. Для оценки эффективности конценгрирования кишечных вирусов из воды был предложен оригинальный метод, основанный на количественном определении вирусных нуклеиновых кислот с ПОМОЩЬЮ ПЦРРВ. Практическая значимость. Сорбент на основе магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния, может быть использован длявысокоэффективного концентрирования кишечных вирусов из воды. Магнитные свойства сорбента позволяют собирать его проточным, методом с помощью сильных . Метод может быть использован для контроля за санитарным состоянием источников водоснабжения. Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ДЛЯ одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов И вируса гепатита А может использоваться в качестве тестсистемы как для контроля. ОКИ.