Аттенуация вируса энцефаломиелита мышей Тейлера путем модификации его 5-нетранслируемой области

• Автор: Хитрина, Елена Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Механизм инициации трансляции эукариотических мРНК

2.2. Особенности первичной структуры генома пикорнавирусов.

2.3. Элементы 5НТО пикорнавирусов, обеспечивающие внутреннее

ПРИСОЕДИНЕНИЕ РИБОСОМ К МАТРИЦЕ

2.4. Белковый аппарат внутренней инициации трансляции

2.5. Вирус энцефаломиелита мышей Тейлера. Фенотипические и структурные ОСОБЕННОСТИ

2.6. Молекулярные основы различной биологической

активности ВЭМТ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Ферменты и реактивы..
3.2. Плазмиды.
3.3. Бактериальные штаммы
3.4. Синтетические олигонуклеотиды.
3.5. Базовые методы молекулярного клонирования.
3.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК с использованием Т7 ДНК полимеразы.
3.7. Конструирование мутантных кДНК ВЭМТ.
3.8. Получение полноразмерных транскриптов.
3.9. Трансфекция и получение вирусных стоков.
3 Определение бляшкообразующего фенотипа.
3 Определение кинетики размножения мутантных вирусов в одноцикловом опыте.
3 Определение матричной активности мутантных РНК.
3 Исследование нейровирулентности
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Геномная структура и бляшкообрлзующий фенотип мутантных вирусов энцефаломиелита мышей Тейлера
4.2. Исследование нейровирулентности мутантных ВЭМТ с геномными перестройками в области ОАТ
4.3. Геномная структура мутантов ВЭМТ с неинициаторным в стартовом окне и их свойства ш vi.
4.4. Исследование нейровирулентности мутантов ВЭМТ с неинициаторным в стартовом окне
4.5. Структура генома вирусов, выделенных из ЦНС животных, зараженных мутантами ВЭМТ
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
5.1. ОлигопиримидинА1Ю тандем является цисактивным элементом,
ЗАВИСИМЫМ ОТ ХОЗЯИНА
5.2. Функциональноструктурные требования для ОЛТ.
5.3. Точечные мутации в трансляционном стартовом окне аттенуируют вирус энцефаломиелита мышей Гейлера.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Тейлера с геномными перестройками нуклеотидными заменами и делениями в области олигопиримидинового блока и со вставками между олигопиримидиновым блоком и кодоном, сконструированных ранее в нашей лаборатории 2 получение и изучение биологических свойств нового класса мутантов ВЭМТ с нуклеотидной вставкой между элементами тандема олигопиримидиновый блок и , в которую внесен новый неинициаторный в различных контекстах, локализующийся в пределах стартового окна и выполняющий функцию второго элемента тандема олигопиримидин . Научная новизна и практическая ценность работы. Данные, полученные при изучении нейровирулентности мутантов ВЭМТ, свидетельствуют о важности тандема олигопиримидинового блока и кодона для эффективной репродукции вируса в нервной ткани мышей. Различные генетические перестройки в области ОЛТ снижают частично или полностью нейровирулентность вируса энцефаломиелита мышей Тейлера. Однако те же самые генетические изменения незначительно сказываются на репродуктивной способности вируса в культуре ткани и на матричной активности соответствующих вирусных РНК в некоторых бесклеточных системах трансляции. Сравнительный анализ результатов, полученных при изучении мутантов ВЭМТ в системах i vi. , обусловленной, вероятно, наличием отсутствием ряда трансфакторов, обеспечивающих внутреннюю посадку рибосом при инициации трансляции. Полущенные результаты открывают новые перспективы как для изучения фундаментальных аспектов механизма внутренней инициации трансляции, так и для дальнейших попыток в разработке живых вакцин. Изучение биологических свойств мутантов Тейлера со вставкой между элементами тандема, в которую внесен новый неинициаторный в различных неоптимальных контекстах показало, что мутанты, имеющие разные неоптимальные контексты , расположенного в стартовом окне, обладая одинаковой степенью аттенуации судя по , могут приводить к развитию различной клинической картины у заболевших животных. Одни мутанты вызывают глубокие параличи с очень высоким уровнем смертности иногда 0, в то время как Другие заболевание средней тяжести, заканчивающееся в большинстве случаев полным выздоровлением. Таким образом, впервые показано, что точечные мутации в 5 НТО вирусной РНК могут поразному влиять на способность вируса вызывать заболевание, с одной стороны, и на течение и исход вирусной инфекции, с другой. Не исключено, что подобное свойство присуще не только вирусу Тейлора, но и другим вирусам, патогенным для человека и животных, и это обстоятельство должно быть принято во внимание при разработке новых подходов к диагностике вирусных заболеваний и лабораторной идентификации вирусов. Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы работы были доложены на VIIIой конференции Молекулярная биология пикорнавирусов Финляндия, , на Хтом международном конгрессе вирусологов Иерусалим, Израиль, , на Хой конференции Молекулярная биология пикорнавирусов Германия, , на научной конференции Актуальные проблемы медицинской вирусологии, посвященной летию со дня рождения М. П. Чумакова Москва, и на семинарах в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН. Инициация белкового синтеза эукариот это сложный многоступенчатый процесс, направленный на формирование инициаторного комплекса на инициаторном кодоне мРНК. Многие детали этого процесса до сих пор остаются неясными, тем не менее, в общих чертах инициация трансляции эукариотических РНК может быть представлена схемой, изображенной на рисунке 2. i, i, . Начинается этот процесс с образования свободных субъединиц, так как в нормальных физиологических условиях в клетках эукариот равновесие между нетранслирующими рибосомами и их субъединицами и сдвинуто в сторону неактивных рибосом. Ассоциация субъединиц предотвращается эукариотическими инициаторными факторами 1А и 3 I, I3, которые связываются с рибосомной субъединицей, образуя комплекс, а субъединица временно блокируется фактором I6 . , . Далее рибосомпый комплекс ассоциирует с тройственным комплексом, состоящим из 2, и , формируя преиннпиаторный комплекс , . . I4 белок, который узнает и связывается с находящимся на 5 конце клеточных мРНК кепом 7X, где X любой нуклеотид . Рис.