Экспериментальные подходы к усовершенствованию и созданию новых профилактических препаратов против клещевого энцефалита

• Автор: Хоретоненко, Михаил Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярнобиологические свойства флавивирусов.

1.1.1. Геном флавивирусов.

1.1.2. Общие представления о структурных белках флавивирусов

1.1.3. Общие представления о неструктурных белках флавивирусов

1.1.4. Репликативный цикл флавивирусов

1.1.5. Сборка и выход вируса из клетки

1.2. Инактивированные вакцины против КЭ

1.2.1. Подходы к усовершенствованию современной вакцины против

1.2.1.1. Адъюванты.
1.2.1.2. Способы инактивации.
1.2.1.3. Субстраты для накопления вируса.
1.2.2. Подходы к созданию новых вакцин против КЭ
1.2.2.1. Вакцины на основе структурных белков
1.2.2.2. Вакцины на основе неструктурных белков
1.2.2.3. Вакцины, основанные на принципе совместной иммунизации структурными и неструктурными белками вируса КЭ.
1.3. Средства доставки флавивирусных антигенов.
1.3.1. Основные способы презентации флавивирусных антигенов в организме.
1.3.2. Комплексные исследования средств презентации флавивирусных антигенов.
1.3.3. Системы, основанные на технологии рекомбинантных вирусов
1.3.4. Системы, основанные на технологии рекомбинантных бактериальных плазмид.
1.3.5. Вирусоподобные частицы и липосомы
1.3.6. Рекомбинантные белки
1.4. Адъюванты для флавивирусных вакцин.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Вирусы.
2.2. Плазмиды.
2.3. Клеточные культуры.
2.4. Антитела.
2.5. Титрование вируса КЭ на мышах
2.6. Титрование вируса КЭ в культуре клеток СПЭВ
2.7. Получение рекомбинантного вируса осповакцины РВОВ
2.7.1. Получение интеграционной плазмиды.
2.7.2. Получение РВОВ
2.7.3. Клонирование полученного РВОВ методом бляшек под агаровым покрытием
2.7.4. Титрование ВОВ и РВОВ.
2.8. Получение радиоактивно меченных экстрактов зараженных клеток.
2.9. Радиоиммунопреципитация
2 Выбор и синтез пептидовфрагментов неструктурного белка 1 вируса КЭ
2 Иммунизация мышей РВОВ
2 Иммунизация мышей РВОВ и плазмидой V
2 Иммунизация мышей синтетическими пептидамифрагментами
белка 1 вируса КЭ
2 Иммуноферментный анализ ИФА сывороток мышей, иммунизированных синтетическими пептидамифрагментами белка 1.
2 Иммуноферментный анализ проб на содержание
инактивированных вирионов вируса КЭ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.
3.1. Изучение кинетики сорбции инактивированного очищенного препарата вируса КЭ на гидроокиси алюминия.
3.2. Изучение рекомбинантного вируса осповакцины, несущего ген
белка 1 вируса КЭ.
3.3. Изучение схемы совместной вакцинации мышей РВОВ и плазмидой V.
3.4. Иммуногенные свойства пептидовфрагментов белка 1 вируса
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Ранее было показано, что неструктурный белок 1 вируса КЭ наряду с белком Е является одним из основных антигенов мри инфекции Ляпустин и др. Во многих исследованиях подтверждается потенциальная протективная активность белка 1 флавивирусов, в том числе и вируса КЭ . iv . Тимофеев и др. Известно, что этот белок является индуктором клеточного иммунитета . iv . Таким образом, сочетанное применение современной вакцины против КЭ и белка 1 потенциально будет обеспечивать более комплексный и пролонгированный иммунитет. Это определило остальные направления наших исследований. В настоящее время ведется активный поиск новых способов иммунизации против вирусных инфекций. Одним из таких подходов является использование вирусных векторов для одновременной иммунизации против нескольких заболеваний. Одна из распространенных экспериментальных моделей вирус осповакцины ii . i . . Необходимо было изучить возможность создания рекомбинантного вируса осповакцины, способного экспрессировать белок 1 вируса КЭ, и способность такой конструкции защищать животных от вирусной инфекции. Еще одним перспективным способом иммунизации является использование синтетических пептидовфрагментов вирусных антигенов в качестве профилактических препаратов. Сведения об иммуногенных свойствах синтетических фрагментов белка 1 немногочисленны, и необходимо было выяснить особенности иммунного ответа у животных при иммунизации рядом фрагментов указанного белка, а также изучить возможность защиты животных от летальной инфекции КЭ с помощью указанных пептидных препаратов. На основании вышеизложенного целью настоящего исследования было 1 в результате изучения закономерностей процесса сорбции инактивированных вирионов КЭ на гидроокиси алюминия в присутствии и в отсутствие ЧСА обосновать необходимость использования геля гидроокиси алюминия в вакцине против КЭ 2 изучить протективную активность рекомбинантного вируса осповакцины РВОВ, несущего ген белка 1 вируса КЭ, против КЭ в экспериментах на животных 3 изучить протективную активность экспрессирующих систем на основе РВОВ и бактериальной плазмиды но принципу праймбустерной иммунизации в экспериментах на животных 4 изучить иммуногенные свойства синтетических пептидовфрагментов белка 1 вируса КЭ и возможный механизм их протективного действия. Впервые подтверждено ингибирующее действие человеческого сывороточного альбумина ЧСА на процесс сорбции инактивированных вирионов КЭ на геле гидроокиси алюминия. Установлено, что в присутствии ЧСА степень сорбции инактивированных вирионов КЭ снижается в 4 раза. КЭ и ЧСА. Впервые показана протективная активность РВОВ, несущего ген белка 1 вируса КЭ, в экспериментах на мышах. Впервые показана возможность формирования эффективного иммунитета с помощью праймбустер юй вакцинации с использованием РВОВ и бактериальной плазмиды V, несущих ген белка 1 вируса КЭ, в экспериментах на мышах. Впервые установлены иммуногенные свойства синтетического пептидафрагмента белка 1 вируса КЭ. Впервые показана протективная активность данного пептида в экспериментах на мышах. Установлена его способность вызывать образование антител к белку I у экспериментальных животных. Подтвержден антителоопосредованный механизм протективного действия этого пептида. Полученные результаты, описывающие процесс сорбции инактивированных вирионов КЭ на гидроокиси алюминия, указывают на низкую целесообразность использования гидроокиси алюминия в качестве адъюванта вакцины против КЭ. Это касается только препаратов, в которые в качестве стабилизатора после очистки добавляется ЧСА. Наряду с этим отказ от гидроокиси алюминия должен удешевить производство, обеспечить лучшую стандартность вакцины и, возможно, снизить риск местных реакций у вакцинируемых без снижения иммуногенности и протективной активности препарата. Показана возможность формирования протективного иммунитета у животных против вируса КЭ с помощью последовательной иммунизации рекомбинантным вирусом осповакцины и бактериальной плазмидой, несущими ген белка 1 вируса КЭ.