Генотипирование альфавирусов серокомплекса синдбис-западного энцефаломиелита лошадей : Воспроизведение процесса рекомбинации у альфавирусов в культуре клеток при смешанной инфекции

• Автор: Селиванова, Татьяна Константиновна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

1.1. Общие черты строения геномов альфавирусов

1.2. Гены белков полимеразного комплекса

1.3. Синтез белков нуклеокайида оболочки, кодируемых

субгеномной 5 РНК

1.4. Сборка нуклеокапсидов и вирионов альфавирусов. Формирование химерных вирионов

1.5. Функциональная характеристика гликопротеидов оболочки

Глава 2. Рекомбинация у вирусов с непрерывным РНК

геномом

2.2.1. Строение геномов вирусоврекомбинантов

2.2.2. Экспериментальные доказательства процесса рекомбинации на модели ВС

Глава 3. Полимеразная цепная реакция ПЦР для

обнаружения и индикации РНКсодержащих вирусов
3.1. Основные характеристики метода ПЦР
3.2. Цели и варианты ПЦР анализа
3.3. Подходы к разработке метода ОТПЦР анализа дня индикации альфавирусов
Часть 2 Собственные исследования.
Глава 4. Материалы и методы.
4.1. Альфавирусы культивирование и определение инфекционности
4.2. Смешанное инфицирование клеточных культур двумя видами альфавирусов
4.3. Реакция нейтрализации инфекционной активности альфавирусов
4.4. Приготовление материала для ПЦРанализа из природных изолятов альфавирусов ссрокомплекса СиндбисЗЭЛ
4.5. Методы выделения РНК альфавирусов
4.6. Постановка ОТПЦР
4.7. Рестрикция ДНК продуктов ОТПЦР
4.8. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
4.9. Блот гибридизация ПЦР продуктов с
олиго нуклеотидным и зондами. Исследование генетической структуры РНК вирусоврекомбинантов
4.9.1. Метка зондов в реакции кинирования
4.9.2. Перенос ПЦРпродуктов на мембраны
4.9.3. Процедура гибридизации с Р зондами
4 Расчет олигонуклеотидных ПЦРпраймеров и гибридизационных зондов
Глава 5. Результаты исследований.
5.1. Гепотипирование вирусов серокомплекса СиндбисЗЭЛ методом ОТПЦР и рестрикционного анализа
5.1.1. Структура олигонуклеотидных праймеров вирусов Синдбис ВС
5.1.2. Амплификация и рестрикция участков генов эталонных штаммов вирусов Синдбис
5.1.3. Структура олигонуклеотидных праймеров вирусов
5.1.4. Амплификация и рестрикция участков генов шР2 и Е2 эталонных штаммов вируса ЗЭЛ Мак Миллан
5.2. Генетические связи и биологические свойства
географических вариантов альфавирусов серокомплекса СиндбисЗЭЛ
5.2.1. Анализ географических вариантов вирусов Синдбис
5.2.2. Сходство и различие американских вирусов ЗЭЛ и ЗЭЛподобного вируса У из России Удмуртия
5.2.3. Дифференциация антигеннородственных вирусов Синдбис и ЗЭЛ методом ОТПЦР
5.3. Рекомбинация у альфавирусов
5.3.1. Сравнение участка рекомбинации СЕ2 у географических вариантов вируса ЗЭЛ
5.3.2. Моделирование процесса рекомбинации при смешанной инфекции вирусами ВЭЛ и ВКЛ в культуре клеток
5.3.3. ОТПЦР анализ гибридных форм РНК в составе вирионов
5.3.4. Сравнительный рестрикционный анализ участков геномов рекомбинантных вирусов и вирусовродителей
5.3.5. Результаты сравнительного изучения инфекционной активности и антигенного состава вирусной популяции, образующейся при смешанной инфекции, и исходных родительских вирусов
5.3.6.Гибридизационный анализ генетической структуры области рекомбинации
Глава 6 Обсуждение
ВыводыЛ
Список литературы


Представленные результаты исследований по оптимизации метода ОТПЦР для определения генетического материала альфавирусов серокомплекса СиндбисЗЭЛ демонстрируют решение ряда поставленных в этом направлении задач. О применении метода ПЦР для индикации вирусов ВсЭЛ, циркулирующих на территории Северной и Южной Америки, сообщили зарубежные авторы Vi . Строение генома и этапы репродукции альфавирусов хорошо изучены на модели вируса Синдбис вирионная РНК, размером тыс. С, Е2, и белки, участвующие в сборке вириона ЕЗ и 6К, синтезируются на матрице субгеномной РНК. Геном вируса ЗЭЛ имеет рекомбинантное происхождение от двух родителей 5 и гены белков полимеразного комплекса и белка нуклсокапсида родственны генам вируса ВсЭЛ, а гены белков оболочки и участок 3 имеют высокое сходство с аналогичными областями генома ВС. Поэтому объединение вирусов ЗЭЛ и Синдбис в один серокомплекс на основании только антигенных взаимосвязей не соответствует данным об их генетической структуре. В связи с этим возникает необходимость разработки методов генной дифференциации этих вирусов. У ряда РНК содержащих вирусов животных и растений с позитивным непрерывным геномом показан процесс рекомбинации в системах ин виво и ин витро а. Актуальным является изучение явления рекомбинации у вирусов при смешанной инфекции как модель для выяснения возможностей образования рекомбинантов в природных условиях. Образование рекомбинантных РНК было показано в условиях трансфекции клеток фрагментами РНК ВС и при высокой множественности заражения, ведущей к образованию дефектных частиц i а. До настоящего времени публикации о межвидовой рекомбинации альфавирусов в эксперименте при смешанной инфекции отсутствовали. Целью диссертационной работы было генотипирование природных изолятов вирусов серокомплекса СиндбисЗЭЛ и воспроизведение явления рекомбинации у альфавирусов при смешанной инфекции. Применение метода ОТПЦР с последующим рестрикционным анализом участков генов для дифференциации вирусов Синдбис и ЗЭЛ. Проведение генотипирования природных изолятов альфавирусов серокомплекса СиндбисЗЭЛ, выделенных в разных географических регионах. Моделирование процесса межвидовой рекомбинации у альфавирусов в условиях смешанной инфекции вирусами ВЭЛ и ВКЛ в культуре клеток. Выявление рекомбинантных альфавирусов методами ОТПЦР, рестрикции и гибридизации среди природных ЗЭЛподобных вирусов и в популяции, образующейся при смешанной инфекции. Разработан способ дифференциального обнаружения вирионной РНК альфавирусов серокомплекса СиндбисЗЭЛ в биопробах с помощью метода ОТПЦР и последующей рестрикции ДНКпродуктов. Предложенный способ основан на обязательном анализе вирусных генов, кодирующих белки полимеразного комплекса и структурные белки вирионов альфавирусов, и связан с наличием в этой группе вирусоврекомбинантов. Метод апробирован на природных изолятах с неизвестной первичной структурой генома, выделенных в разных географических регионах. Использование предложенного метода позволяет получить дополнительные характеристики вирусов, классифицирующие их как Синдбис и ЗЭЛподобные. Установлено, что российский вирус У является вариантом особо опасного вируса ЗЭЛ Мак Миллан, циркулирующего на американском континенте. Впервые описано образование межвидовых рекомбинантов вирусов ВЭЛ и ВКЛ при смешанной инфекции в культурах клеток и способ их выявления методами ОТПЦР и гибридизации с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов в качестве генетических маркеров. Выяснены закономерности накопления рекомбинантных вирусов и их родителей в смешанной популяции в условиях естественной селекции и иммунного давления. Показано доминирование в популяции высокорепродуктивного родителя вируса ВЭЛ и быстрое преимущественное образование на его основе вирусоврекомбинантов в области генов структурных белков, ускользающих от действия нейтрализующих антител обоих вирусовродителей. Наблюдается вытеснение из популяции менее активного вирусародителя ВКЛ. Полученные данные позволяют обьяснить возникновение в природе рекомбинантного вируса ЗЭЛ, унаследовавшего высокую репродуктивную активность от вируса ВсЭЛ и приобретшего измененные антигенные свойства.