Разработка методов получения и культивирования первичных и перевиваемых культур клеток животных для производства вирусных вакцин

• Автор: Хапчаев, Юсуф Хаджи-бекович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 180 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Методы получения и культивирования свежеизолированных клеток животных для вирусологических исследований.

1.1. Ферментативная дезагрегация измельченных кусочков ткани

1.2. Перфузионный способ дезагрегации паренхиматозных органов

1.3. Способы выращивания первичных культур клеток

Глава 2. Применение линий клеток человека и животных

для получения вирусных вакцин

2.1. Характеристика линий клеток человека и животных.

2.2. Способы выращивания перевиваемых линий клеток.

2.3. Перевиваемые линии клеток субстраты для получения
вирусных вакцин
Заключение по обзору литературы
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Глава 3. Материалы и методы исследований.
3.1. Культуры клеток и методы работы с ними
3.1.1. Культуры клеток.
3.1.2. Методы получения первичных культур клеток.
3.1.3. Пассирование клеток.
3.1.4. Изучение кинетики роста клеток в культуре.
3.1.5. Хранение клеток в жидком азоте и восстановление
их после криоконсервации.
3.1.6. Кариологичсский анализ культур
3.1.7. Морфологическое изучение культур клеток.
3.1.8. Контроль культур клеток на безопасность.
3.2. Методы вирусологических исследований
3.2.1. Вирусы.
3.2.2. Размножение вакцинных штаммов вирусов полиомиелита, клсшевого энцефалита, бешенства, чумы плотоядных в клетках
линий и V.
Глава 4. Разработка способов перфузионной трипсинизации почек
и селезенок зеленых мартышек
4.1. Перфузионная дезагрегация почек обезьян i i
4.2. Перфузионная дезагрегация почек обезьян i vi.
4.3. Перфузионная дезагрегация селезенок обезьян i vi.
Заключение по главе 4.
Глава 5. Создание и аттестация посевных и рабочих банков
перевиваемых линий клеток обезьян.
Заключение по главе 5.
Глава 6. Экспериментальные разработки по применению
линии клеток для получения противовирусных препаратов
6.1. Разработки по созданию вакцины против полиомиелита.
6.2. Разработки по созданию вакцины против клещевого энцефалита.
6.3. Разработки по созданию новой вакцины против чумы плотоядных.
6.4. Культивирование вакцинных штаммов вируса бешенства
Заключение по главе
Глава 7. Разработка технологии выращивания культур клеток
и вакцинных штаммов вирусов полиомиелита и клещевого энцефалита на микроносителях в биореакторах
7.1. Культивирование клеток линии в условиях псевдосуспензии
7.2. Разработка метода псевдосуспснзиоиного культивирования клеток линии V
7.3. Применение псевдосуспснзиоиного метода культивирования
клеток линии V для накопления вакцинных штаммов вирусов
7.3.1. Культивирование клеток линии V и вакцинных штаммов вируса полиомиелита штаммы Сэбина типа I, II и III на микроносителе Цитодекс1 в биореакторе i
7.3.2. Культивирование клеток линии V и вируса клещевого энцефалита штамм Софьин на микроносителе Цитодекс
в спиннсрах
Заключение по главе 7.
ОБСУЖДЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ Вакчум вирусвакцина сухая культуральная против чумы плотояд
Г6ФДГ глюкозо6фосфатдегидрогеназа
ГЛАХИ смесь 0,5 раствора гидролизата лактальбумииа и среды Игла на растворе Хенкса
ГЛАЭИ смесь 0,5 раствора гидролизата лактальбумииа и среды Игла на растворе Эрла
ККГЛ вирус конгокрымской геморрагической лихорадки Комитет МИБП М3 РФ Комитет медицинских иммунобиологиче ских препаратов М3 РФ
КПЗМ первичная культура клеток почек зеленых мартышек
КЭ вирус клещевого энцефалита
ЛДГ лактатдегидрогеназа
ЛДК линия диплоидных клеток
ЛХМ вирус лимфоцитарного хориоменингита
МИБП медицинские иммунобиологические препараты
МИ микроноситель
ОПВ оральная полиомиелитная вакцина
ПЛК перевиваемая линия клеток
СКРС сыворотка крови крупного рогатого скота
СХО сестринские хроматидиые обмены
ЯОР ядрышкообразующие районы хромосом
диметилсульфоксид
, ii, i i
ВВЕДЕНИЕ Общая характеристика работы.
Актуальность


Е., к. Петручук Е. М., принимавшим участие в проведении совместных экспериментов по аттестации банков клеток линий и V. Глава 1. Методы получения и культивирования свсжсизолированных клеток животных для вирусологических исследований. Разработка метода культур клеток человека и животных i vi обеспечила бурный прогресс в различных областях биологии, медицины и биотехнологии. В настоящее время ведется промышленное использование эукариотических клеток для получения различных биологически активных веществ, в том числе и противовирусных вакцин, в постоянно возрастающих масштабах. Становление метода культур клеток было связано с успешным культивированием i vi дискретных клеток и их небольших конгломератов, полученных в результате расщепления различных тканей животных с помощью протеолитических ферментов. В вирусологическую практику процедуру трипсинизации с целью получения монослойных культур клеток ввели . М.V 4,5. Эти авторы описали метод трипсинизации и получения культур клеток из куриных эмбрионов, а также из органов обезьян. Триумфом применения метода тканевых культур в вирусологии явилось создание эффективных вакцин против полиомиелита на первичных культурах клеток почек обезьян ,,,4,5,7. Первичные культуры клеток сыграли в дальнейшем выдающуюся роль в развитии вирусологии и вирусной вакцинологии. До сих пор первичные культуры остаются основным клеточным субстратом при производстве различных противовирусных вакцин. Определяющим этапом при получении первичных культур клеток человека и животных является дезагрегация исходных тканей на дискретные клетки или небольшие клеточные конгломераты, способные к размножению в условиях i vi. Выбор способа диссоциации определяется типом ткани, возрастом животногодонора, доступностью донорского материала. Применяемые в настоящее время методики позволяют получать взвеси жизнеспособных клеток практически из всех здоровых или малигнизированных органов и тканей прс и постнатального периода жизни человека и животных 1,,,,,,,,,,,1,3. Диспергирование субстратов с помощью механической или химической обработки наиболее часто используют при работе с эмбриональными и ранними постнатальными тканями, а также при работе с малыми количествами исходного материала биопсия или в случаях, когда применение протеолитических ферментов нежелательно ,,,5,1. Самым распространенным способом дезагрегации тканей является обработка их протеолитическими ферментами в комплексе с механическим иили химическим воздействием. Наиболее широко в качестве диспергента используют трипсин ,,1,6,4. Однако вследствие высокой специфичности протеолитических ферментов к субстрату, трипсин неодинаково эффективен при дезагрегации различных тканей. Это послужило основанием для использования других протеолитических ферментов в качестве диспергентов. Широко используют для ферментативного расщепления тканей коллагеназу. Этот фермент по сравнению с трипсином обеспечивает более щадящие условия дезинтеграции тканей и позволяет существенно повысить долю жизнеспособных клеток в первичных взвесях 0,1,3. Но коллагеназа практически не используется в производственных условиях изза высокой себестоимости. Эффективными диспергентами тканей оказались и нейтральные протеазы. В отличие от трипсина они активны в широком диапазоне 4,,0 и температуры СС. Кроме того, с помощью этих ферментов дезагрегацию тканей можно проводить в питательной среде с сывороткой крупного рогатого скота, что способствует увеличению выходов клеток с высокими ростовыми потенциями 2,7. В связи с тем, что в ряде обзоров имеется детальное описание различных модификаций трипсинизации измельченных кусочков органов и тканей человека и животных, мы не будем на них подробно останавливаться 1,,,,1,3. Отметим, что все они имеют один существенный недостаток низкие выходы жизнеспособных клеток из 1 г исходной ткани. Повысить выходы свежеизолированных клеток удается с помощью последовательного использования различных протеолитических ферментов, их комбинаций друг с другом или с хелатными агентами ,, ,1.