Ламинин-связывающий белок как клеточный рецептор для вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей

• Автор: Бондаренко, Евгений Иванович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 161 с. : 9 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список использованных сокращений
Введение
Глава 1. Обзор литературных данных.
1.1. Общая характеристика альфавирусов
1.1.1. Эпидемиология вируса ВЭЛ
1.1.2. Географическое распространение вирусов комплекса ВЭЛ
1.1.3. Особенности патогенеза вируса ВЭЛ. 22 1.2. Структура вирионов вируса ВЭЛ.
1.2.1. Характеристика вириона
1.2.2. Организация вирусного генома. 29 1.3. Начальный этап проникновения альфавирусов в клетку.
1.3.1. Клеточные рецепторы для альфавирусов
1.3.2. Взаимодействие альфавирусов с гепарансульфатом
1.3.3. Исследование рецептора для вируса ВЭЛ на клетках комара
1.3.4. Рецептор-связывающие домены альфавирусов
1.3.5. Особенности проникновения альфавирусов в клетку
1.4. Ламинин и ламининсвязывающий белок.
1.4.1. Ламинин, строение, связывающие сайты и рецепторы
1.4.2. Строение ламининсвязывающего белка
1.4.3. Роль ЛСБвнорме и патологии. 50 Глава 2. Исходные материалы и основные методы.
2.1. Исходные материалы.
2.1.1. Материалы и реактивы
2.1.2. Рекомбинантные белки
2.2. Основные методы.
2.2.1. Животные
2.2.2. Вирусные препараты
2.2.3. Клеточные культуры

2.2.4. Иммунизация животных
2.2.5. Получение гибридом синтезирующих МКА к рЛСБ
2.2.6. Криоконсервация гибридных клеточных линий
2.2.7. Наработка препаративных количеств МКА in vivo
2.2.8. МКА к вирусу ВЭЛ
2.2.9. Очистка препаратов МКА
2.2.10. Определение класса и подкласса иммуноглобулинов МКА
2.2.11. Биотинилирование белков
2.2.12. Иммуноферментный анализ (ИФА).
2.2.12.1. Взаимодействие рекомбинантного ЛСБ и вируса ВЭЛ
2.2.12.2. Взаимодействие ПКА и МКА против рЛСБ с клетками Vero
2.2.12.3. Выявление гликопротеина Е2 вируса ВЭЛ с помощью ИФА в инфицированных клетках
2.2.12.4. Конкурентный анализ взаимодействия рЛСБ с вирионами ВЭЛ
2.2.12.5. Определение концентрации специфических антител к рЛСБ
2.2.12.6. Картирование рЛСБ с помощью МКА в конкурентном иммуноферментном анализе (КИФА)
2.2.12.7. Определение констант связывания вируса ВЭЛ с рЛСБ
2.2.12.8. Определение констант связывания антител с рЛСБ
2.2.13. Электрофорез
2.2.14. Иммуноблоттинг
2.2.15. Ингибирование репликации вируса ВЭЛ при помощи антител против рЛСБ
2.2.16. Реакция нейтрализации. 71 Глава 3. Результаты и обсуждение исследований.
3.1. Взаимодействие рекомбинантного ЛСБ с вирионами вируса ВЭЛ
3.2. Взаимодействие рЛСБ с вирусом ВЭЛ в иммуноблоте
3.3. Конкурентный анализ взаимодействия рекомбинантного ЛСБ с вирионами ВЭЛ

3.4. Исследование ингибирования репликации вируса ВЭЛ
посредством блокирования эпитопов ЛСБ на клетках поликлональными антителами
3.5. Зависимость ингибирования репликации вируса ВЭЛ от
температуры и времени добавления антител после инфицирования клеток
3.6. Ингибирование синтеза вирусного гликопротеина Е2 в клетках Vero
3.7. Получением характеризация МКА к рЛСБ
3.8. Пополнение коллекции гибридом к рекомбинантному ЛСБ
3.9. Характеризация МКА
3.10. Изучение антигенной структуры ЛСБ при помощи МКА
3.11. Блокирование репликации вируса ВЭЛ на культуре клеток
с помощью МКА против рЛСБ
3.12. Результаты нейтрализации вируса ВЭЛ
3.14. Заключение
Выводы
Список работ опубликованных по теме диссертации
Благодарности
Список используемой литературы

высокоаффинный ламининовый рецептор неинтегриновой природы, так называемый ламининсвязывающий белок (ЛСБ). Молекулярная масса этого белка составляет 67 кДа. Однако в независимых исследованиях было установлено, что открытая рамка считывания ЛСБ кодирует белок, состоящий лишь из 295 аминокислотных остатков. Этот белок с молекулярной массой 37 кДа, как предполагают, является предшественником 67 кДа ЛСБ [95], [269]. МКА 1СЗ взаимодействовало с 248 по 295 ао ЛСБ, что дало основание предположить факт взаимодействия вируса Синдбис с С-концевым районом ЛСБ [269]. В этой же работе было показано, что трансформация клеток ВНК векторами, обеспечивающими стабильную экспрессию ЛСБ, давала увеличение связывания радиоактивно меченого вируса с клетками в 4,5 раза и увеличение эффективности бляшкообразования в 7 раз. Экспрессия антисенс-РНК приводила к снижению чувствительности клеток к вирусу. Это позволило авторам предположить, что ЛСБ является рецептором для вируса Синдбис на клетках ВНК. Антирецепторное МКА 1СЗ оказалось способно блокировать связывание вируса Синдбис с клетками мышей, обезьян и человека. Анализ аминокислотной последовательности ЛСБ хомячка и мыши показал, что она полностью идентична. ЛСБ человека, хомячка и коровы отличались всего лишь по двум . аминокислотным остаткам. Факт эволюционного консерватизма ЛСБ может служить объяснением широкого тропизма хозяев для вируса Синдбис. МКА 1СЗ лишь незначительно блокировало (<10%) взаимодействие вируса с клетками ФЭК. Эти результаты подтвердили ранее полученные данные, что рецептор для вируса Синдбис на клетках ФЭК отличается от рецептора клеток млекопитающих [270]. МКА 1СЗ взаимодействовало с белком, имеющим молекулярную массу 71-кДа, который предположительно считался ламининсвязывающим белком клеток ФЭК. Сравнение аминокислотной последовательности ЛСБ клеток ФЭК показало его высокое сходство с ЛСБ человека, гомология около 98% [246]. Таким образом есть основание полагать, что ЛСБ на клетках ФЭК может