Молекулярно-биологическая характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки

• Автор: Гмыль, Лариса Вениаминовна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

Введение I

мм1ммаммммммммммммммммтмм

1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика семейства Вшуапшоле

1.1.1. Таксономия и классификация

1.1.2. Морфология

1.1.3. Структура и организация геномов, стратегия кодирования вирусных белков .

1.1.4. Трансляция и процессинг вирусных баков.

1.2. Общая характеристика рода найровирусов

1.2.1. Классификация

1.2.2. Морфология и физикохимические свойства вирионов найровирусов

1.2.3. РНК и особенности ее репликации у найровирусов.
1.2.4. Вирусспецифические баки найровирусов.
. Краткие сведения о крымскойконго геморрагической лихорадке и ее возбудителе
1.3.1. Лабораторная диагностика ККГЛ
1.3.2. Экспериментальная инфекция на животных и адаптация вируса ККГЛ к различным культурам клеток.
2. Материалы и методы
2.1. Вирусы .
2.2. Культура клеток.
2.3. Животные
2.4. Бактериальный штамм
2.5. Синтетические олигонуклеотиды .
2.7. Клещи .
2.8. Получение иммунных асцитных жидкостей. .
2.9. Титрование инфекционного вируса
2 Выращивание и концентрирование вируса ККГЛ
2 непрямой метод флюоресцирующих антител
2 Непрямой иммуноферментный анализ
2 Электронная микроскопия . .
2 Получение радиоактовно меченых препаратов вируса ККГЛ
2 Иммунопреципитация вирусспецифических белков
2 Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле
2 ДВУМЕРНЫЙ электрофорез вирусспецифических белков
2 Очистка вируса ККГЛ в градиенте плотности сахарозы .
2 Выделение нуклеокапсидов
2 Выделение РНК вируса ККГЛ.
1. Обратная транскрипция. .
2. Полимеразная цепная реакция ПЦР
3. Базовые методы молекулярного клонирования
2 Аналитический электрофорез в агарозном геле.
5. Секвенирование.
2 Приготовление секвенирующего геля и проведение электрофореза
3. Реультаты .
3.1. Определение нуклеотидной последовательности Б, М и Ь сегментов штамма Ходжа вируса ККГЛ
3.1.1. Определение нуклеотидной посчедовательности Б сегмента штамма Ходжа
3.1.2. Определение нуклеотидной посчедовательности М сегмента штамма Ходжа
3.1.3. Определение нуклеотидной последовательности 5 концевого участка вирионной РНК
1сегмента штамма Ходжа вируса ККГЛ.
. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Б, М СЕГМЕНТОВ И ФРАГМЕНТОВ Ь СЕГМЕНТА ШТАММОВ ВИРУСА ККГЛ .
3.2.1. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Б сегментов штаммов вируса ККГЛ . .
3.2.2. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей М сегментов штаммов вируса ККГЛ
3.2.3. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности части Ь сегмента штаммов вируса ККГЛ.
3.3. Компьютерный анализ полученных нуклеотидных и аминокислотных
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 5, М И Ь СЕГМЕНТОВ ШТАММА ХОДЖА. .
3.3.1. Анализ 5 сегмента штамма Ходжа
3.3.2. Анализ М сегмента штамма Ходжа
3.3.3. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 5концевой части Ь сегмента.
3.4. АДАПТАЦИЯ ВИРУСА ККГЛ ШТАММА ХОДЖА К КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК УЕЯ0Е6.
3.4.1. Получение варианта штамма Ходжа ХоджаА вируса ККГЛ. адаптированного к культуре клеток УегоЕб
3.4.2. Сравнение основных характеристик вариантов ХоджаМ и ХоджаА
3.5. Изучение реализации генома вируса ККГЛ в культуре клеток УеяоЕ6 .
3.5.1. Идентификация вирусспецифических белков вируса ККГЛ и определение их молекулярных масс на.модели двух вариантов шт. Ходжа.
3.5.2. Динамика накопления вирусных белков при репродукции в культуре клеток вариантов штамма Ходжа вируса ККГЛ.
3.6. анализ белкового состава вирионов и нуклеокапсидов вируса ККГЛ
3.6.1. Очистка вирионов вируса ККГЛ с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы и определение белкового состава вирионов
3.6.2. Выделение нуклеокапсидов варианта ХоджаА вируса ККГЛ и анализ белкового состава
3.7. Изучение гликозилирования вирусспецифических белков вируса ККГЛ.
. Изучение свойств вирусспецифических белков с помощью двумерного
ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
3.1а Выявление РНК вируса ККГЛ в различных биопробах с помощью Г1ЦР.
4.Обсужденне
4.1 Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Б, М и фрагментов ь сегментов штаммов вируса ККГЛ.
4.2. Организация Б и м РНК сегментов штамма Ходжа
4.3. Адаптация вируса ККГЛ к культуре клеток УейоЕ6 и изучение свойств полученного варианта ХоджаА
4.4. Выявление РНК вируса ККГЛ с помощью метода ОТГТЦР.
Выводы .
Список л итературы

Список сокращений
ак аминокислотаы
БОЕ бляшкообразующая единица
ИП иммунопреципитация
ИПБ иммунопреципитационный буфер
ИФА иммуноферментный анализ кДНК комплементарная ДНК
КЖ культуральная жидкость
КГЛ Крымская геморрагическая лихорадка
ККГЛ КрымскаяКонго геморрагическая лихорадка
ЛД летальная доза
МФА метод флюоресцирующих антител
НБМ новорожденные белые мыши нт нуклеотид ы
5 и ЗНТО 5 и 3 нетранслируемые области
ОРС открытая рамка считывания
ОТобратная транскрипция
ААГ полиакриламидный гель
ПНК прямое негативное контрастирование
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтиленгликоль вРНК вирионная РНК кРНК комплементарная РНК мРНК матричная РНК
РСК реакция связывания комплемента
ТМЭД тетраметилэтилендиамин
ТХУ трихлоруксусная кислота
ТЦД тканевая цитопатическая доза
ФР физиологический раствор
ЦНС центральная нервная система
ЦПД цитопаггическое действие
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
i ix дезоксирибонукпеозид5трифосфат ы
iii дитиотреит
ii i vi Овечья болезнь Найроби
i i i морфолинпропансульфоновая кислота i i оптическая плотность
додецилсульфат натрия
Введение


Эти выступы представляют собой поверхностные гликопротеины, которые встроены в липидный бислой вирусной оболочки, имеющей толщину нм. Флебовирусы имеют круглые, упакованные близко друг к другу упорядоченные морфологические единицы диаметром нм с центральной полостью размером 5 нм i . Поверхностная структура хантавирусов, также как и флебовирусов отчетливо упорядочена и имеет уникальный квадратный сеткоподобный вид i . Вирионы буньявирусов имеют поверхность, покрытую ручкоподобными морфологическими единицами без определенного порядка. Для найровирусов на поверхности вирионов описаны маленькие неупорядоченные поверхностные структуры с углублением в центре ККГЛ, Кольюб и Дугбе . Поверхность тосповирусов внешне похожа на поверхность найровирусов. На поверхности негативно окрашенных вирионов обнаружены гликопротеиновыс выступы в виде бахромы ii . Геном всех представителей семейства vii представлен тремя одноцепочечными негативными или амбиполярными сегментами , М, РНК. Концевые нуклеотидные последовательности высоко консервативны для вирусов внутри одного рода, но отличаются для вирусов из разных родов. Предполагают, что кольцевая конфигурация РНК и соответствующих вирусных нукпсокапсидов в форме сковороды определяется комплементарными 3 и 5 концами. Непосредственные доказательства спаривания концов вирусной РНК были получены при изучении РНК, выделенной из вирионов вируса Уукуниеми, с помощью электронной микроскопии, когда наблюдали три кольцевые фрагмента РНК Неш1еП еХ а. Таблица 1. Сегменты РНК в комплексе с белком представляют собой индивидуальные нуклеокапсиды , М и со спиральной структурой ii . В инфекционных вирионах должно содержаться, по крайней мерс, по одному , М и рибонуклеокапсиду, однако, в зрелые вирионы не всегда упаковывается одинаковое количество нуклеокалсидов. При выделении нуклеокапсиды и сегменты РНК редко содержатся в эквимолярном соотношении. Обычно преобладает сегмент i , ii i, . Различное число упакованных нуклеокапсидов может влиять на размер вирусных частиц. Возможно, этим объясняется большой разброс в размерах вирионов, который наблюдали при электронной микроскопии . Для флебо и тосповирусов было показано, что в состав нуклеокапсида вместо вирионной РНК вРНК может входить комплементарная РНК кРНК i . Для буньявируса Ла Кросс кРНК сегмента была обнаружена во вновь синтезированных вирионах в клетках насекомых, но не в клетках животных. Значение этого феномена не установлено . Бунья, ханта и найровирусы используют строго негативную стратегаю кодирования, сегмент флебовирусов, а также и М сегменты тосповирусов амбиполярны. Дтя всех родов вирусов показано, что РНК сегмента кодирует в комплементарной последовательности нуклеокапсидный белок . Кроме того, у родов бунья, флебо, тосповирусов сегмент кодирует неструктурный белок , причем способ кодирования этого белка различается у представителей разных родов. В отличие от вирусов из других родов буньявирусы имеют самый маленький сегмент, который кодирует в комплементарной последовательности с перекрывающихся рамок трансляции два белка и рис. Присутствие белка в зараженных клетках было продемонстрировано для нескольких представителей рода буньявирусов i, . При клонировании 5концов индивидуальных мРНК буньявируса зайцабеляка и анатизе комплементарных ДНК кДНК последовательностей мРНК сегмента этого вируса был обнаружен только один тип субгеномной мРНК сегмента. Таким образом, одна мРНК с двойной открытой рамкой считывания ОРС буньявирусов дат два белка и . По сравнению с вирусами других родов ханта и найровирусы кодируют самые большие нуютеокапсидные белки . Однако, точных данных о кодировании неструктурного белка для этих вирусов нет. Большинство хантавирусов имеют вторую, перекрывающуюся ОРС, кодирующий потенциал которой приблизительно 7 кД. Белок не был обнаружен в клетках, инфицированных хантавирусами, однако уменьшение частоты нуклеотидных замен в регионе, кодирующем белок , указывает на возможность двойного кодирования. Это навело авторов на мысль, что дополнительная ОРС может реализовываться, но крайней мере, у трех хантавирусов Пуумала, Тула и Син Номбре i .