Получение и применение моноклональных антител для изучения белков вирусов Марбург и Эбола

• Автор: Казачинская, Елена Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 118 с.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

1.1. Вирусы Марбург и Эбола. Характеристика возбудителей и вызываемых ими геморрагических лихорадок

1.1.1. Средства для профилактики и лечения филовирусных геморрагических

лихорадок

1.1.2. Репродукция филовирусов в культурах клеток

1.1.3. Патогенность филовирусов для лабораторных животных

1.1.4. Морфология и структура вирнонов, классификация филовирусов

1.1.5. Организация генома, структу ра и функции белков.

1.1.6. Иммунитет при филовнрусных инфекциях

1.1.7. Иммунодиагностика филовирусных заболеваний

1.1.8. Современные подходы к созданию вакцинных препаратов против
фнловирусов
1.2. Моноклональные антитела МКА и их применение в изучении и выявлении вирусных антигенов.
1.2.1. Использование МКА в иммунодиагностике вирусных инфекций.
1.2.2. Исследование и картирование антигенных детерминант на вирусных белках с помощью МКА
1.2.3. МКА к филовирусам получение, свойства и применение.
1.3. Использование рекомбинантных белков в иммунодиагностике заболеваний и изучении антигенных детерминант на вирусных
белках
Заключение.
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы и методы
2.1.1. Материалы и реакт ивы.
2.1.2. Вирусные препараты
2.1.3. Сыворотки и иммуноглобулины к вирусу Марбург
2.1.4. Сыворотки и иммуноглобулины к вирусу Эбола
2.1.5. Рекомбинантные белки филовирусов
2.2. Основные методы.
2.2.1. Культивирование клеток мышиной миеломы 0.
2.2.2. Имму низация животных.
2.2.3. Получение гибридом
2.2.4. Клонирование гибридом.
2.2.5. Криоконссрвация гибридных клеточных линий.
2.2.6. Наработка препаративных количеств МКА i viv.
2.2.7. Методы очистки МКА
2.2.8. Измерение концентрации белков.
2.2.9. Определение класса и подкласса моноклональных иммуноглобулинов
2.2. Приготовление конъюгатов антител с биотином.
2.2. .Электрофорез белков
2.3. Иммунологические методы.
2.3.1. Твердофазный нммуноферментный анализ
2.3.2. Конку рентный нммуноферментный анализ.
2.3.3. Определение константы аффиннносгн МКА.
2.3.4. Иммуноблот
2.3.5. Реакция нейтрализации.
2.3.6. Антителозависимый лизис инфицированных вирусом клеток.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Исследование препаратов вирусов Марбург и Эбола, используемых для получения гибридом и определения специфичности антител.
3.1.1. Получение и изучение препаратов вируса Марбург поиск оптимального способа инактивации инфекционности и оценка антигенных свойсгв.
3.1.2. Тестирование препарата вируса Эбола.
3.2. Получение коллекции гибридом, проду цирующих МКА к филовирусам. Характеристика гибридомных МКА.
3.2.1. Получение коллекции гибридом, продуцирующих МКА к вирусу Марбург
3.2.2. Свойства МКА к вирусу Марбург.
3.2.3. Исследование биологической активности МКА против вируса Марбург.
3.2.4. Получение коллекции гибридом, продуцирующих МКА к вирусу Эбола
3.2.5. Свойства МКА к вирусу Эбола.
3.3. Изучение перекрестной реактивности антивирусных поликлональных и моноклональных антител с вирусами Эбола и Марбург
3.4. Исследование с помощью МКА роли отдельных филовирусных белков в формировании антигенной структу ры вирионов
3.4.1. Топологическое картирование антигенных сайтов и эпитонов на белках 1ЧР, УР, УР вируса Марбург.
3.5. Сравнительное изучение антигенных и имму ногеиных свойств природных и рекомбинантных филовирусных белков
3.5.1. Изучение белка УР вируса Эбола и его рекомбинантного аналога.
3.5.2. Изучение белков УР, УР вируса Марбург и их рекомбинантных аналогов
3.6. Изучение возможности использования инактивированного вируса Марбург и рекомбинантных белков филовирусов для выявления специфических
иммуноглобулинов класса против ВМ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
Список используемой литературы


Исследовать возможность использования рекомбинантных антигенов в ИФА для выявления специфических противовирусных антител в сыворотках иммунизированных животных и человека, переболевшего лихорадкой Марбург. Создание оригинальной коллекции гибридом, секретирующих моноклональные антитела к белкам КР, УР и УР вируса Марбург и к белкам КР и УР вируса Эбола. Анализ пространственной структуры сайтов и эпитопов антигенов филовирусов с использованием полученной панели МКА. Построение карты антигенной структуры внутренних белков вируса Марбург. Результаты сравнительного изучения антигенных и иммуногенных свойств природных и рекомбинантных белков ОР, ЫР, УР и УР филовирусов. Возможность использования рекомбинантных антигенов аналогов природным, при конструировании тестсистем для иммунодиагностики филовирусов Марбург и Эбола. Научная новизна работы. В результате проведенных исследований, получена и исследована оригинальная панель МКА к структурным белкам ЫР, УР и УР филовирусов Марбург и Эбола. Показано, что иммунизация животных инакгивированными препаратами данных вирусов вызывает иммунный ответ организма на внутренние нуклеокапсидные белки. Выявлена взаимная перекрестная реактивность филовирусных белков, это белки КР и УР ВМ для поликлональных антител к ВЭ и белок ЫР ВМ для одного вида МКА, специфичных к ВЭ. Показано сходство антигенных структур рекомбинантных белков , V и V вируса Марбург и белков V вируса Эбола с природными, формирующими иммунный ответ организма. Проведено тополог ическое картирование эпитопов белков , V и V вируса Марбург. По полученным данным можно предположить, что сайты и эпитопы белков , V и V ВМ пространственно перекрываясь, формируют сложные конформационные антигенные детерминанты. Идентифицирован один сайт, присутствующий на антигенной структуре природных и рекомбинантных белков V вируса Эбола. Оценена возможность использования рекомбинантных белков , , V и V вируса Марбург в качестве антигенов в ИФА для выявления специфических противовирусных антител в сыворотках иммунизированных животных и человека, переболевшего лихорадкой Марбург. Практическая ценность работы. Сформирована коллекция гибридом и получены препараты МКА к структурным белкам , V и V вируса Марбург и к белкам и V вируса Эбола. Получены поликлональные антитела к рекомбинантным вирусным белкам. Па основе рекомбинантных белков разработана экспериментальная система твердофазного ИФА для выявления специфических антител к вирусу Марбург. Апробация работы. X Ii Vi, . Ii i i i. IX Международная конференция новые информационные технологии в медицине и экологии. Крым, Гурзуф . VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвистиций. Московская обл. Пущино . Публикации. Iv, v, v, . I. ii . I. v. X ii vi, , I, . I v, . I ii, v, v. I v, . I ii, v, . V. , . V. i. I v, . I ii, v, . V. , . V. i. Ii i i i, . Разумов И. А., Казачинская Е. И., Беланов Е. Ф., Качко А. В., Сорокин А. В. Использование моноклональных антител и рекомбинантных белков для создания новых систем для выявления вируса Марбург. Крым, Гурзуф . С. 0. Казачинская Е. И., Терновой В. А., Перебоев А. В., Разумов И. А. Моноклональные антитела к вирусу Эбола свойства и использование для выявления вирусных антигенов. Крым, Гурзуф . С 3. И.А. Разумов, Е. И. Казачинская, Е. Ф. Беланов, А. В. Качко. Использование моноклональных антител и рекомбинантных белков для выявления вируса Марбург. Пущиио , тезисы докладов, с. А.В. Качко, А. В. Сорокин, Е. И. Казачинская, А. В. Иванова, Е. Ф. Беланов, И. А. Разумов, А. А. Букреев, . Нетесов С. В. г. Пущино , тезисы докладов, с. И.А. Разумов, Е. Ф. Беланов, А. А. Букреев, Е. И. Казачинская. Моноклональные антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимическая характеризация. Вопросы вирусологии 6. А.В. Сорокин, Е. И. Казачинская, А. В. Качко, А. В. Иванова, А. А. Букреев, И. А. Разумов. Сравнительное исследование антигенных и иммуногенных свойств природного и рекомбинантного белков V вируса Марбург. Вопросы вирусологии 5. И. А. В. Сорокин, И. А. Разумов, Е. И. Казачинская, А. В. Качко, А. В. Иванова, В. П. Мишин, А. А. Букреев, В. Б. Локтев, С. В. Нетесов.