Разработка и получение диагностических тест-систем к вирусу герпеса человека 6-го типа и их применение для изучения HHV-6 инфекции

• Автор: Мельниченко, Анна Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. Вирус герпеса человека 6го типа, краткая характеристика, структура, репликация, сборка вирусных

ГЛАВА 2. Клеточный тропизм и ростовые свойства ННУ6

2. 2 Культивирование клеток в среде, содержащей ростовые протеины

ГЛАВА 3. Патогенез, клиника, эпидемиология ННУ6.

3.1. Патогенез и пути передачи ННУ6 инфекции

3.2. Клинические проявления ННУ

3.3. Эпидемиология ННУ6.

ГЛАВА 4. Диагностика и лечение ННУ6.

4.1. Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций

4.2. Концентрирование и очистка вирусов
4.3. Лечение ННУ6 инфекции
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Основные реактивы и препараты, используемые в работе.
Клетки.
Вирусы.
Культивирование вируса.
Оценка жизнеспособности клеток, определение
концентрации и пролиферативной активности клеток.
Консервация и деконсервация клеточных культур
Получение лизата клеток
Использование ростовых протеинов.
Концентрирование и очистка вируса герпеса 6го типа
Электронная микроскопия
Определение концентрации белка в препаратах
Электрофорез и иммуноблотгинг
Иммуноферментный анализ
Метод непрямой иммунофлюоресценции.
Статистическая обработка результатов исследований
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 6. Оптимизация условий культивирования вируса герпеса человека 6го типа и получение высокоактивных вируссодержащих препаратов.
6.1. Изучение динамики накопления вирусов V6 и В в различных клеточных линиях и определение максимального выхода вируса
6.2. Использование различных линий клеток при культивировании V6 и адаптация к средам и сывороткам
отечественного производства
6.3. Использование ростовых протеинов при культивировании Т лимфобластоидных клеточных линий и
инфицированных V6.
ГЛАВА 7. Препаративное получение концентрированных и очищенных антигенов вируса герпеса человека 6го типа и изучение иммунобиохимических свойств.
7.1. Концентрирование и очистка вируса герпеса 6го типа
7.2. Исследование антигенной активности полученного препарата вируса в тИФА
7.3. Исследование очищенного и концентрированного препарата вируса в электрофорезе.
7.4. Исследование методом электронной микроскопии
ГЛАВА 8. Отработка оптимальных условий проведения тИФА
8.1 .Определение оптимальной концентрации антигена для
сорбции
8.2. Определение длительности и температурного режима
сорбции
ГЛАВА 9. Выявление антител к вирусу герпеса человека 6го типа в сыворотках больных методом тИФА
9.1. Скрининговые исследования человеческих сывороток
9.2. Определение специфичности исследуемых сывороток в отношении белков V6 в иммуноблотгинге.
9.3. Сопоставление разработанных диагностических тестсистем к V6 тИФА, нИФ, иммуноблоттинга при исследовании сывороток крови.
ГЛАВА . Изучение противовирусного действия ряда
противовирусных препаратов на репродукцию вируса
герпеса 6го типа i vi.
.1. Исследование цитотоксичности препаратов ФМК и ацикловира на клетках
.2. Исследование противовирусного действия препаратов ФМК и ацикловира на репродукцию вируса герпеса 6го
типа i vi и определение ХТИ.
ГЛАВА И. Обсуждение полученных результатов.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ДНК ННУ6 обнаружены в лимфомных клетках при лимфогранулематозелимфоме Беркитга. ННУ6 связывают с некоторыми поспрансплантационными осложнениями. Установлена способность ДНК ННУ6 неопластически трансформировать клетки ЫШ ЗТЗ. Первичная инфекция среди взрослых отмечается довольно редко. Высокие уровни антител отмечаются у больных с иммунологическими нарушениями, что обусловлено реактивацией вируса. Тяжесть и острота процесса этих заболеваний определяется инфекционной активностью этого вируса. Способность вирусов герпеса сохраняться в популяции хозяина обеспечивает существование стертых и различных атипичных клинических форм инфекции, латентное носительство. Кроме того, герпесвирусы обладают уникальной способностью к пожизненной персиситенции в организме хозяина и могут обеспечивать заболевание в ассоциации с другими вирусами и возбудителями, что значительно затрудняет диагностику. Поэтому, в создавшейся ситуации заметно повышается интерес к методам лабораторной диагностики ННУ6 инфекции и созданию тестсистем , которые отсутствуют на данный момент в нашей стране. Приведенные данные свидетельствуют, что вирус ННУ6 ассоциируется с различной патологией человека, но роль его в возникновении этих заболеваний остается до конца не выясненной. Открытие еще одного представителя семейства вирусов герпеса вируса герпеса 6го типа вариант А и вариант В, патогенного для человека, привело к необходимости изучения биологических свойств вируса, клинических проявлений ННУ6 инфекции, к проведению сероэпидемиологических исследований по распространенности указанного агента в человеческой популяции. В нашей стране таких исследований не проводилось, поэтому проблема изучения вируса ННУ6 весьма актуальна и необходимость в таких исследований стоит очень остро. Целью настоящей работы являлась разработка и получение современных отечественных тестсистем для диагностики V6 индуцированных инфекций человека с последующей клинической апробацией и изучением распространенности V6 в человеческой популяции в нашей страны. Изучить распространение V6 инфекции в человеческой популяции нашей страны. Исследовать ряд противовирусных препаратов на V6. Изучена антивирусная активность ряда препаратов в отношении V6 инфекции i vi. Определены чувствительные клеточные лимфобластоидные линии для культивирования V6 на отечественных питательных средах и сыворотках с использованием ростовых протеинов,полученных из сывороток свиней и крупного рогатого скота. Получены диагностические тестсистемы тИФА, нИФ, иммуноблоттинга на основе высокоактивных антигенных препаратов вируса и показана возможность их использования для выявления антител к V6. Установлено значительное ингибирующее действие фосфономуравьиной кислоты на репродукцию вируса герпеса 6го типа i vi. Апробация работы. Основные положения работы были представлены на VI Всероссийском Симпозиуме Биология клетки в культуре СанктПетербург, ноябрь , на Научнопрактическом Симпозиуме Национальные дни лабораторной медицины России Москва, октябрь г Материалы диссертационной работы были доложены на заседании Отдела Государственной Коллекции вирусов и экспериментального производства марта г Института Вирусологии. В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на заседании апробационного Совета по медицинской вирусологии Института Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН апреля . Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего источника отечественных авторов и 5 источников зарубежных авторов. Диссертация изложена на 0 страницах машинописного текста, содержит 3 таблиц, рисунков и фотоснимков клеточных препаратов. Публикация результатов исследования. Основные положения диссертации отражены в четырех опубликованных научных работах. Диссертационная работа выполнена в плане научных исследований НИР гос. ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН директор Института академик РАМН Д.