Конструирование нацеленных аденовирусных векторов посредством генетической модификации вирусного капсида

• Автор: Белоусова, Наталья Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Birmingham
• Количество страниц: 184 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .

1.1. Общая характеристика аденовирусов .

1.2. Структурные белки капе ид а Ад

1.2.1. Гексон.

1.2.2. Основание пентона

1.2.3. Шип

1.2.4. Белок р1Х

1.3. Инфекционный цикл Ад.

1.3.1. Проникновение Ад в клетки

1.3.2. Дезинтеграция вириона

1.3.3. Экспрессия генов и репликация ДНК
1.3.4. Сборка вирусных частиц и выход их из клетки
1.4. Рецепторы, используемые Ад для проникновения в клетки
1.4.1. Первичные рецепторы
1.4.2. Вторичные рецепторы .
1.5. Стратегии таргетинга
1.6. Трансдукцнонный таргетинг .
1.6.1. Нацеливание Ад с помощью комплексов адаптерлиганд
1.6.2. Генетическая модификация тропизма Ад
1.6.2.1. Таргетинг Ад с помощью замещения шипов или ГД шипов
1.6.2.2. Таргетинг Ад с помощью генетического включения лиганда в капсидные белки .
1.6.2.2.1. Модификация основания пептона .
1.6.2.2.2. Модификация гсксона
1.6.2.2.3. Модификация белка р1Х
1.6.2.2.4. Модификация ГД шипа .
1.6.2.2.4.1. Встраивание лигандов на СконецГД шипа.
1.6.2.2.4.2. Встраивание лигандов в Н1петлю шипа .
1.6.2.3. Замена шипа химерным белком
1.6.3. Клеточные линии для получения нацеленных векторов .
1.7. Аденовирусные векторы как терапевтические агенты
Заключение
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .
2.1. Материалы
2.1.1. Бактериальные штаммы.
2.1.2. Эукариотические клетки
2.1.3. Антитела и белки
2.1.4. Реактивы.
2.2. Молекулярнобиологические методы.
2.2.1. Методы, используемые в молекулярном клонировании.
2.2.2. Получение рекомбинантных плазмид
2.2.3. Экспрессия рекомбинантных белков в бактериальных клетках
и их очистка
2.2.4. Экспрессия белка РРСОЬ в эукариотических клетках .
2.2.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Иммуноблотгинг.
2.2.6. Иммуносорбционный ферментный анализ .
2.2.7. Проточная цитофлюоримстрия.
2.3. Методы, используемые при работе с аденовирусами .
2.3.1. Гомологичная рекомбинация в Е.соИ .
2.3.2. Трансфекция .
2.3.3. Наработка вирусов
2.3.4. Определение физического и инфекционного титров Ад .
2.3.5. Выделение ДНК из вирионов .
2.3.6. Траисдукция клеток Ад векторами
2.3.7. Определение кинетики развития вирусной инфекции .
2.3.8. Радиомечение белков Бметионином
2.3.9. Мечение вирусов метил3 тимидином.
2.3 Связывание меченых 3Нтимцдином Ад с клетками
2.3 Выделение нерастворимых белков из клеток инфицированных Ад. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Получение нацеленных аденовирусов с полипептидными лигандами, встроенными в Н1летлю ГД шипа .
3.1.1. Получение вирусов с удлиннными Iпетлями и подтверждение
их структуры .
3.1.2. Сравнение продуктивности и инфекционности вирусов с модифицированными шипами
3.1.3. Изучение механизмов проникновения вирусов 5. в клетки
3.1.4. Получение шаттлвекторов, позволяющих встраивать
полипептидные лиганды в удлиннные Iпетли .
3.1.5. Характеризация вирусов со встройкой полипептида VI в модифицированные шипы .
3.2. Разработка стратегии таргетинга Ад векторов, основанной на
замещении ГД шипа
3.2.1. Конструирование и характеризация химерного белка 6 .
3.2.2. Получение аденовируса с химерным шипом 6 .
3.2.3. Определение механизма, обеспечивающего связывание с клетками.
3.2.4. Развитие инфекции в клетках, инфицированных .
3.2.5. Выбор в качестве нацеливающего вирус лиганда.
3.2.6. Получение химеры шипфибритин, содержащей .
3.2.7. Получение и характеризация аденовируса, несущего
химерный шип
3.2.8. Включение дополнительного шипа в вирионы, несущие химерный шип
3.2.9. Нацеливание СОЬсодержащих вирусов к дендритным и раковым клеткам.
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Сконструирована серия шатглплазмид, позволяющая эффективно и быстро клонировать кодирующие лиганд последовательности в Н1пстли ГД шипа, удлиннные разными по величине фрагментами гибкой петли ОП, для оптимального представления нацеливающих лигандов рекомбинантным шипом. Продемонстрировано, что У1Рсодержащий вектор, полученный с использованием этих шатглплазмид, обладает повышенной инфекционностью на КАРнегативных клетках, что делает его потенциально полезным для доставки генов в такие клетки. Разработана принципиально новая стратегия таргетинга, основанная на замещении шипа Ад химерной молекулой и позволяющая решить две главные задачи, связанные с нацеливанием Ад векторов разрешение структурной и функциональной несовместимости лиганда и шипа, а также обеспечение специфичного связывания с рецептороммишенью. Установлено, что созданная химерная молекула эффективно тримеризуется при генетическом слиянии с нацеливающими белковыми лигандами, обладающими сложной третичной конформацией, и сохраняет способность встраиваться в Ад вир ионы. КАРсвязывающсм сайте, увеличивает их инфскционность, не изменяя при этом специфичность связывания с рецептороммишенью. Сконструированы нацеленные к Ад векторы, эффективно и специфично трансдуцирующис дендритные и опухолевые клетки яичников и мочевого пузыря человека. Эти векторы являются наиболее эффективными из известных в настоящее время средств доставки генов в названные типы клетокмишеней, а потому могут служить прототипами терапевтических векторов для генетической иммунизации против рака и инфекционных агентов. Альтернативно, сконструированные на их основе условнорепликативные вирусы могут быть использованы для уничтожения метастазирующих злокачественных, экспрессирующих опухолей посредством их селективной трансдукции. Получение серии из восьми Ад векторов, , содержащих встройки размером от до а. Iпетле ГД шипа Ад5 и подтверждение их структуры. Определение влияния размера встроек в Iпетле на продуктивность вирусной инфекции, инфекционность вирусов и их тропизм. Создание серии шаттлплазмид I. Ппетли всех восьми конструкций. Получение вирусов 5VI, со встройкой VI в Iпетлях, содержащих дополнительные линкеры размером 5, , и а. Изучение механизмов проникновения модифицированных вирусов в клетки. Создание химерной молекулы шипфибритин6Нтаг 6, предназначенной для замещения шипа в капсидс Ад. Определение способности химеры тримеризоваться, встраиваться в Ад вмрионы и обеспечивать их связывание с искусственным рецептором ИР. Определение, насколько критичной для правильной упаковки и связывания с рецептором является присутствующая в дисульфидная связь. Создание химерной молекулы шипфибритин, включающей в качестве лиганда подобный домен . Получение вектора, несущего химерный СОЬсодержащий шип. Определение его инфекционности и специфичности взаимодействия с . Создание мозаичного вектора, содержащего помимо химерного шипа, полноразмерный шип Ад5 с мутацией в КАР связывающем сайте. Сравнение его инфекционности с инфскционностью вируса содержащего только химерный шип. Сравнение эффективности трансдукции дендритных и опухолевых клеток человека СОЬсодержащими вирусами с таковой не модифицированного вируса, содержащего шип дикого типа. Третьей, Четвертой и Пятой Ежегодной Конференции i i Денвер, Колорадо, Сиэттл, Вашингтон, Бостон, Массачусетс, , на конференции i i i iv в i i , , на Ежегодном Медицинском Форуме в ivi ii, Бирмингем, Алабама, и . Результаты обсуждались на семинаре в , Бирмингем, Алабама, июль . V., iiv I. Xi . V., v . V Vi. V . V., i V. V i vi Ii i i i i i. Vi. V., i V. V. i vi v i xi . Vi, в печати. V., iv . V. I. V., v . V. ivi vi v ii iv vi i i i. V. i i vi v ii i i i x I. V. , . V., i V. V., v, . V., iv, V. X Ii Vi. V., i V. V. v i vi v i xi . V. . V., v . V., i V. V Л 3 Ii i vi, I, 5, . V., i V. V. v i vi V i ii . Автор выражает глубокую благодарность В Н. Красных за помощь н руководство работой, Н. П. Корохову за обсуждение результатов по ходу выполнения работы, В. Г. Крсндсльщиковой за участие и помощь в работе, А. В. Персбоеву, В. В. Терновому и С. А Шестопал за критические замечания при прочтении рукописи.