Изучение свойств интерполиэлектролитных комплексов для ингибирования вирусной репродукции in vitro

• Автор: Слита, Александр Валентинович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 108 с. : ил.

Введение

Нель исследования

Задачи исследования

Научная новизна

Научнопрактическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Обзор литературы

1. Проблемы химиотерапии вирусных инфекций

1.1. Резистентность вирусов

1.2. Индукторы интерферона в терапии вирусных инфекций

1.3. Побочное действие противовирусных препаратов
2. Физиологически активные полимеры как лекарственные средства
2.2. Обоснование применения полимеров в фармакологииИ
2.3. Принципы создания полимерных препаратов
2.4. Свойства полимерных препаратовИ
3. Генотерапия новое направление в медицине
3.1. Механизмы действия олигонуклеотидов
3.2. Развитие генотерапевтических подходов от лаборатории к клинике
3.3. Доставка и защита нуклеиновых кислот проблемы и пути их решения
3.3.2. Химическая модификация плазмид и олигонуклеотидов
3.3.3. Недостатки использования модифицированных нуклеиновых кислот
3.4. Векторы для доставки ЛНК в клетки
3.4.1. Свойства липосомньIX векторов
3.4.2. Свойства ретровирусных векторов
3.4.3. Свойства аденовирусных векторов
3.4.4. Достоинства и недостатки вирусных и липосомиых векторов
3.5. Белковые трансфекционные векторы
4. Полимерные катионы как транфекционные векторы
4.1. Токсичность трансфекционных иоликатионов
4.2. Образование комплексов ДНКполикатион
4.3. Перемещение ИПЕК через клеточную и ядерную мембраны
4.4. Повышение эффективности трансфекции клеток ИЕК
4.4.1. Свойства ИЛЕК на основе катионных блоксополимеров
4.4.2. Свойства ИПЕК на основе дендримеров полиамидоаминов
4.4.3. Рецепторопосредованиый транспорт ИПЕК
4.4.4. Перенос ЛНК с помощью хитозановых наносфер
Материалы и методы
Клеточные культуры
Вирусы
Плазмиды и олигонуклеотиды
Поликатионы
Получение вируссодержащей жидкости
Получение интерполиэлектролитных комплексов и оценка эффективности связывания поликатионов с ДНК
Исследование физических свойств интерполиэлектролитных комплексов
а. Низкоградиентная вискозиметрия
Ь. Динамическое двойное лучепреломление
с. Спектральные исследования
Электронная микроскопия
Определение токсичности иоликатионов и их комплексов с ДНК
Трансфицирование клеточных культур интерполиэлектролитными комплексами
Оценка эффективности трансфекции
Определение вирусингибирующей активности исследуемых веществ
Исследование вирусиигибирующего действия антисмысловых олигонуклеотидов в составе ИПЭК
Результаты и обсуждение
1. Образование и физические свойства интерполюлектролитных комплексов
1.1. Оценка эффективности связывания поликатионов с ДНК
1.2. Низкоградиентная вискозиметрия
1.3. Спектральные исследования
1.4. Динамическое двойное лучепреломление
1.5. Электронномикроскопические исследования
2. Биологические свойства интерполиэлектролитных комплексов
2.1. Токсичность поликатионов и их комплексов с ДНК
2.2. Оценка эффективности трансфекции
3. Вирусингибирующая активность исследуемых веществ
3.1. Определение вирусингибирующей активности поликатионов
3.2. Определение вирулицидного действия веществ
3.3.Определение виростатического действия веществ
3.4. Определение влияния веществ на связывание вирусных частиц с клеточной мембраной
3.5. Вирусингибирующий эффект антисмысловых олигонуклеотидов в составе ИПЭК против ВПГ 1 в культуре инфицированных клеток Уею
3.6. Морфологическое изучение противовирусной активности антисмысловых олигонуклеотидов в составе ИПЭК против ВПГ 1
3.7. Ультраструктурное изучение противовирусной активности антисмысловых олигонуклеотидов в составе ИЭК против ВПГ 1
3.8. Вирусингибирующий эффект антисмысловых олигонуклеотидов в составе
ИПЭК против цитомегаловируса человека в культуре клеток ФЛЭЧ
Выводы
Список литературы


Одним из направлений в разработке новых препаратов направленного противовирусного действия является использование специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые взаимодействуют только с комплементарными нуклеотидными участками соответствующих нуклеиновых кислот. Поскольку используемые олигонуклеотидные последовательности комплементарны участкам кодирующих, т. Антисмысловые олигонуклеотиды могут выступать в качестве ингибиторов вирусной репликации. Так, препарат фомивирсен, представляющий собой антисмысловой олигонуклеотид, эффективен при терапии ретинита, вызванного цитомегаловирусом, у больных СПИД i Т. Однако лишь малая часть чужеродной ДНК проникает через клеточную мембрану, и, попав в цитоплазму, очень быстро деградирует под действием клеточных ферментов. Полимерные катионы образуют с ДНК устойчивые комплексы, с высокой эффективностью транспортируют ее внутрь клетки, защищая от действия эндонуклеаз, и имеют ряд преимуществ удобство в храпении и очистке, простота тестирования токсичности и безопасности и, что особенно важно для генной терапии, снижение риска патогенетических и иммунологических осложнений. Наиболее широко используются в генотерапевтических исследованиях полиЬлизин, полиэтилснимин ix В. А., М. Цель исследования. Целью настоящего исследования явилась характеристика биологических и физических свойств комплексов полиаллиламина, полидиметиламиноэтилмстакрилата и их производных с плазмидной ДНК и антисмысловыми олигонуклеотидами для ингибирования репродукции вируса герпеса типа и цитомегаловируса человека. Задачи исследования. Изучить эффективность связывания исследуемых полиаминов с ДНК. Исследовать токсичность полиаллиламина, полиди метилами ноэтилметакрилата и их производных в культуре клеток. Изучить трансфекционную активность интерполиэлектролитных комплексов полиаминДНК i vi. Изучить влияние интерполиэлектролитных комплексов полиаминов с антисмысловыми олигонуклеотидами на репродукцию вируса простого герпеса 1го типа и цитомегаловируса в культуре клеток. Научная новизна. Впервые показано вирулицидное действие полиаллиламина, полидиметиламиноэгилметакрилата и их производных в отношении вируса простого герпеса и цитомегаловируса i vi. Впервые показано, что низкомолекулярные полиаллиламин и полидиметиламиноэтилметакрилат в низких концентрациях эффективно переносят ДНК в эукариотические клетки i vi, не проявляя токсичности. Разработан высокоэффективный способ трансфекции эукариотических клеток. Впервые показано, что антисмысловые олигонуклеотиды в составе интерполиэлектролитных комплексов с полиаллиламином, полидиметиламиноэтилметакрилатом и их производными способны проникать в клетки и ингибировать вирусную репродукцию. Научнопрактическая значимость работы. Разработан быстрый и эффективный способ трансфекции эукариотических клеток с помощью катионных полимеров. В результате проведенных исследований показана возможность использования иптерполиэлектролитных комплексов антисмысловых олигонуклеотидов с синтетическими поликатионами для инг ибирования вирусной репродукции, что представляет большой интерес для поиска новых подходов в терапии вирусных инфекций. Основные положения, выносимые на защиту. Полиаллиламин, полидиметиламиноэтилметакрилат и их производные образуют устойчивые комплексы с ДНК, обеспечивая ее траисмембранный перенос и защиту от клеточных гидролаз. Антисмысловые олигонуклеотиды в комплексе с синтетическими поликатионами способны проникать в инфицированные клетки и ингибировать вирусную репродукцию. Интерполиэлектролитные комплексы полиаллиламина и полидиметилами ноэтилметакрилата с ДНК способны с высокой эффективностью трансфицировать эукариотические клетки и могут быть использованы для разработки средств генной терапии. С. Петербург, г. II Всероссийский Каргинский симпозиум Химия и физика полимеров в начале XXI века, Черноголовка, . Международная конференция Идеи Пастера в борьбе с инфекциями, СанктПетербург, . I. . IV Всероссийская конференция, посвященная 0летию акад. В.А. Каргина Наука о полимерах му веку, Москва, .